引
言
随着生物制药技术的迅猛发展,抗体-药物偶联物(ADC)作为一种高效且有针对性的药物类型,正逐步在肿瘤治疗中展现出其独特的优势。ADC药物的疗效在很大程度上取决于其内化效率,即抗体能否有效地被靶细胞内化并释放药物。在这一背景下,DT3C重组蛋白作为评价抗体内化效率的重要工具,正受到越来越多研究者的关注。
PART.1
ADC内化效率检测原理
DT3C(Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2, C3)是一种重组表达的融合蛋白,由白喉毒素的Fragment A(仅毒素部分)和G群链球菌的3C片段(IgG结合部分)融合而成。该蛋白能够与抗体的Fc端高度亲和,与抗体结合的DT3C分子在抗体被内吞时一同进入细胞。DT3C可以与任何IgG型抗体结合,因此可用于检测来自不同物种的抗体内化效率。DT3C与抗体结合后形成的mAb-DT3C偶联物在体外模拟ADC药物的作用机制,有助于在药物研发早期阶段评估抗体的内化能力和药物的释放效率。
(a) DT3C由催化(Cat)、转位(T)和Fc结合(3C)结构域组成。DT3C的Fc结合结构域特异性地与抗体结合。
(b) mAb-DT3C偶联复合物识别并结合细胞表面抗原后,mAb-DT3C-抗原复合物被内化。,其中DT3C的转位末端被细胞弗林蛋白酶切割,DT3C的催化结构域被释放到细胞质中,DT3C释放出具有毒性的DT,DT能够抑制EF2-ADP核糖基化的活性,阻断蛋白翻译过程,最终导致细胞死亡。
未进入细胞的DT3C则不具有杀伤细胞的活性,因此可根据细胞杀伤情况来评价抗体的内化效率。
PART.2
检测步骤
01
制备mAb-DT3C偶联物
将DT3C蛋白和目的抗体在室温下孵育30分钟,形成mAb-DT3C共轭物。
02
共培养
将mAb-DT3C偶联物直接加到含有抗原阳性细胞(如肿瘤细胞)的完全培养基中进行孵育。
03
检测内化效率
通过流式细胞术或荧光显微镜等方法,检测细胞活力或细胞死亡情况,从而评估抗体在细胞表面的内化效率。
PART.3
DT3C检测ADC药物抗体内化效率优势
广泛适用性:可与来自不同物种(如人、小鼠、兔、山羊)的任何IgG结合。
高效性:在室温下孵育30分钟即可形成mAb-DT3C偶联物。DT3C在细胞内能够迅速释放出具有毒性的DT,从而快速评估抗体的内化效率。
内化效率高:分子量小于Mab-ZAP,mAb-DT3C内化效率高于mAb-Mab-ZAP。
便捷性:通过流式细胞术或荧光显微镜等方法,即可快速、准确地检测mAb在细胞表面的内化效率。
注意事项:在进行体外检测时,应确保实验条件的一致性,如细胞种类、细胞浓度、DT3C和抗体的比例、孵育时间等。需要严格控制实验过程中的无菌操作,以避免外界因素的干扰。
展
望
随着生物制药技术的不断发展,ADC药物在肿瘤治疗中的应用前景日益广阔。然而,ADC药物的疗效受多种因素影响,其中抗体的内化效率是关键因素之一。因此,对抗体内化效率的准确评估对于ADC药物的研发具有重要意义。DT3C重组蛋白作为一种高效、简便、广泛适用的评价工具,将在ADC药物研发中发挥越来越重要的作用。未来,随着DT3C技术的不断完善和应用领域的拓展,相信将为ADC药物的研发提供更多有力的支持。
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DT3C (Diphtheria toxin & spg 3C domain) Protein, Corynephage beta
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