超高分辨显微镜的发展及其在生物医学领域的应用

显微镜的产生和发展对于生命科学研究的进步有至关重要的作用，它将微观世界呈现在大家面前，包括微生物的存在、组织细胞结构及生理病理活动等。显微镜技术的不断革新将成像分辨率不断提高，但相当长一段时间内光学成像无法突破一个极限值，即xy轴横向分辨率约200nm，z轴纵向分辨率约500nm，因此小于这个尺寸的生命活动和结构，如病毒、亚细胞结构等无法清楚地观察到。

聚焦点的光强会根据点扩散函数（point spread function，PSF）而展开，对于圆形孔径，PSF呈现为艾里斑（Airy disk）的模式。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的分辨率取决于PSF的大小，如果焦点很小，则每个像素点获取到的信息也很小，从而得到清晰锐利的图像；反之，则结果图像变得模糊。因此，CLSM成像的主要挑战在于实现越来越小的PSF以获得更好的分辨率。德国物理学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe，1840-1905年）在19世纪70年代首次提出阿贝衍射极限，即由于衍射效应，PSF大小与λ/NA成正比（d=0.61λ/NA），其中λ是光的波长，NA是物镜最重要的参数——数值孔径。由于可见光波长范围在400-760nm之间，NA值最大在1.7左右，所以分辨率极限在200nm左右。随着物理学和测量技术的进步，突破衍射极限的显微镜不断涌现，公认的超高分辨显微镜主要有三类，包括结构照明显微镜（Structured Illumination Microscopy，SIM），受激发射损耗显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），和单分子定位显微镜（SMLM）。单分子定位显微镜包括光敏定位显微镜（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。2014年三位科学家史蒂芬·霍尔（Stefan W. Hell）、埃里克·贝兹（Eric Betzig）和威廉·莫纳（William E. Moerner）因他们在超高分辨显微镜技术领域的贡献而获得了诺贝尔化学奖。当然，新兴最低光子数显微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）作为第四类超高分辨显微镜，也被更多的学者了解和关注。

超高分辨显微镜成像既利用了光学显微成像原有的无损性质（与电镜高分辨成像相比），又可以很好地突破普通显微镜中衍射极限对成像分辨率的限制，因此其发明和发展对于生命科学和生物医学研究具有非常重要的意义。不同类型的超高分辨显微镜自问世后均被广泛应用于生命科学领域中，包括生命体细胞结构和功能的探索以及疾病的发生发展机制等。不过，不同类型的超高分辨显微镜由于空间分辨率、时间分辨率、光漂白和光损伤等诸多问题，实际应用中各有利弊。虽然成像技术发展很快，但技术限制依旧存在，如何获得更高的空间分辨率、更深的成像深度和更快的时间分辨率以满足更精确更快生物过程的研究依旧任重道远。

SIM技术的前身可以追溯到20世纪70年代初。当时，光学学家特奥多尔·赫普恩（Theodor Häupl）首次提出了使用周期性光栅照明来提高显微镜分辨率的想法。这奠定了SIM技术的基础，尽管当时还没有实体的SIM显微镜。21世纪初期，SIM技术开始广泛传播，吸引了生物学家和显微镜专家的关注，它是一种相对低成本的超高分辨率成像方法，因为它不需要昂贵的激光设备或复杂的样品准备。

SIM本质是激发光透过可横向移动的光栅产生正弦条纹图案照射样品，正弦条纹照明图案与样品本身的信息叠加形成莫尔条纹，将样品结构中的高空间频率信息转变为可通过物镜收集的较低空间频率信息，最后通过后期数据处理得到样品的高分辨图像。SIM的单幅原始图像的采集速度只取决于样品的荧光信号强度和探测器的采集速度，通常只需要采集9帧原始图像，与基于点扫描成像的STED和需要采集几万帧原始图像的SMLM相比，要快得多，基本可以达到实时观察。但SIM受其成像原理的制约，最多只能将横向分辨率提升为传统显微镜的2倍（即100 nm左右），因此分辨率远不及其他超高分辨显微镜技术。但SIM对荧光探针没有光开关或抗淬灭的特殊需求，其最大的优势也是宽场成像速度快，所以更多更广泛地应用在活细胞成像领域。

单分子定位显微镜中荧光标记的单个分子被分别激发和检测，可以极高的精度确定单分子的中心从而实现高分辨率，包括光敏定位显微镜（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

PALM的历史可以追溯到2006年，由埃里克·贝兹（Eric Betzig）和哈拉尔德·赫斯（Harald Hess）提出了单分子定位这一概念。同期STORM的成像技术也发展起来，代表是华人科学家庄小威。STORM和PALM工作原理类似，都是通过特殊的分子标记和随机活性化，实现单分子定位进而实现超高分辨率成像。在SMLM成像中，光开关荧光蛋白（PALM）或闪烁染料（STORM）扮演着重要角色，它们在“开态”和“关态”间可以相互转换，处于开态时可被激发产生荧光，而处于关态时不发射荧光。在每一个成像周期内随机只让一小部分荧光团打开，其余荧光团暂时关闭，这样每一幅图像中荧光团的光斑不会重叠，可以高精度地定位出每个荧光团的位置。重复这个过程，使每个周期内都随机打开一部分荧光团，这样可以在不同时间点捕获标记物的位置，通过记录标记物的位置可以得到它们的坐标，获得足够多的数据点可将所有的定位信息叠加起来，就能重构出一幅超分辨图像。这种以成像时间换取空间分辨率的形式，使得PALM或STORM的分辨率通常能够达到数十纳米。

德国科学家Stefan W. Hell于1994年首次理论上提出STED显微镜的概念，并在2000年进行实验验证。STED超高分辨技术的基础原理是利用受激发射效应减小有效荧光发光面积，即在STED显微成像中，通过使用一个激发光束和一个环形的耗损光束，使得荧光分子的激发区域比阿贝衍射极限更小。耗损光束通过受激发射将外围的荧光分子去激发，只留下中心区域的荧光信号，从而实现纳米级别的分辨率。我们也叫它“甜甜圈”技术。STED成像技术可以通过非线性效应提高分辨率，即其分辨率与STED“甜甜圈”损耗光强有关，提高“甜甜圈”光的强度可以使荧光光斑焦点中心直径缩小，但是实际应用中，光损伤较大，“甜甜圈”光强不可能无限增加，顾其分辨率最高可达到30nm左右。此外，STED成像技术还包括对光束进行精确调制、校准和扫描，以及采用高性能探测器进行成像，加之其“甜甜圈”光毒性、光淬灭等问题比较明显，STED技术对荧光染料和封片剂的抗淬灭要求较高。

近年来，得益于新的硬件革新及技术手段的引入、荧光染料和探针的改进、光学系统的优化和更精确的成像算法等，STED技术在分辨率和应用方面都有了显著提升，发展为易用、稳定的成熟商业产品，逐步成为生物医学领域中重要的研究工具。STED技术结合荧光寿命成像更是发挥了降低损耗光强度优势、打破相近波长染料不可共染的限制，进一步降低了光漂白、提高了分辨率。

STED技术的发明人Stefan W. Hell于2017年在Science上发表了他的又一个突破性技术——最低光子数显微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）。在实际成像中，激光功率不可能无限高，荧光基团的稳定性（抗光漂白性）也不可能无限好，所以很多超分辨技术的实际分辨率是没办法达到理论最佳值的，但MINFLUX不是靠检测尽可能高的荧光强度作为目的，而是以检测到尽可能低的荧光信号为目标。MINFLUX技术结合了单分子定位显微镜（SMLM）和STED显微镜的优势，能以高达10kHz的频率跟踪分子运动，每100μs分辨一次分子运动，比传统方法快100倍，并能获得1 - 3nm（3D）的空间分辨率，可解析单分子微小结构，因此也被称为显纳镜。

在MINFLUX跟踪中，环形激发光束（这里的甜甜圈光束是激发光束，而不是擦除光束）围绕单个荧光团扫描，根据在特定位置测量的强度，计算荧光团的精确坐标，并在下一次迭代之前将扫描图案重新定位在该位置。保持荧光团靠近光束的暗中心活动可以实现高定位精度并将光漂白作用最小化。通过有效利用单个荧光团的有限光子预算，MINFLUX实现了成像的高空间分辨率和荧光团跟踪的高时间分辨率。

在生命科学领域，STED技术以其优异的空间分辨率成为科学家们研究亚细胞结构及蛋白定位的强有力工具。肌动蛋白微丝、微管、线粒体和核孔复合物等细胞结构也被选为常用的标准模型来检验超高分辨成像系统的分辨率。STED超高分辨技术可以揭示核孔复合物（nuclear pore complex, NPC）在早期G1期的蛋白质组成，并使通过NPC输出和输入信使核糖核蛋白复合物和肽的可视化成为可能（Ashkenazy-Titelman et al., Nat Commun., 2022; Shi et al., Proc. Natl Acad. Sci., 2017）。由于DNA复制、修复和转录的动力学不能用电子显微镜来阐明，因此，核内染色质的研究特别受益于新型STED兼容的DNA探针的发展。此外，一些染色质亚结构，如环、弯或超线圈，不能用传统的衍射受限的荧光显微镜来分辨。用YOYO-1标记的λ噬菌体DNA进行STED成像，可分辨DNA的弯曲和扭曲，并证明其足以分辨长度相近的片段（相差约100bp）（Persson et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2011; Kim et al., Anal. Bioanal. Chem., 2016）。与Hoechst偶联的远红染料可以显示异染色质排斥区（直径约155 nm） 或有丝分裂染色体的DNA环（Hell et al., Chem. Sci., 2019; Spahn et al., Nano Lett., 2019）。

线粒体内膜在不同生理条件下可发生重塑，STED超高分辨技术曾展示了人类细胞中相邻的嵴连接（crista junctions, CJs）以可逆和平衡的方式动态地相互作用和分离，使用不同的蛋白标记或两种亲脂性内膜特异性染料对嵴膜（cristae membranes, CM）进行染色，进一步揭示了嵴经历了连续的膜重塑循环，这些事件伴随着不同嵴内膜电位随时间的波动，作者利用多种技术提出了一个CJ动力学模型，该模型在机制上与CM重塑相关，代表了在单个线粒体内发生的嵴膜分裂和融合事件（Kondadi et al., EMBO reports, 2020）。结合STED超高分辨技术以及电子显微技术，Gemmink等首次显示了在人体骨骼肌切片中，PLIN2和PLIN5（perilipin 2和perilipin 5）并不是共定位，而是分别并排定位于细胞内脂滴（Intramyocellular lipid droplets , LD）的不同膜位点，PLIN5除了位于细胞质外，还位于线粒体附近以及线粒体和脂滴的相互作用位点，支持PLIN5参与促进脂肪酸从LD释放，用于线粒体脂肪氧化的观点，PLIN2和PLIN5的空间分布，将有助于我们理解生理和病理生理条件下的肌细胞脂滴脂解（Gemmink et al., BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids,  2018）。

内质网（ER）由相互连接的膜片和小管组成，超高分辨率显微镜发现了密集排列、快速移动的内质网小管，被传统光学显微镜误认为是膜片，这也说明了在活细胞中以高时空分辨率重新审视内质网结构的经典观点的重要性。Schroeder等利用活细胞STED成像首次在活细胞中测定了内质网小管和膜片的纳米级尺寸，揭示了内质网区域内的纳米孔的存在，并表明膜片中的纳米孔不同于均匀膜片和ER矩阵（Nixon-Abell et al., Science. 2016），而是代表了组成内质网子域的膜结构局部连续体的元素，这与教科书中对ER膜片和小管的定义不同，作为活细胞中ER的膜特征，纳米孔提供了一个更全面的ER结构视图，这可能有助于我们未来理解ER结构与疾病之间的关系（Schroeder et al., J. Cell Biol. 2018）。

STED超高分辨技术还助力理解细胞代谢状态变化如何导致细胞器相互作用重新连接的关键。Jang等发现饥饿诱导的内体募集MTM1（在人类x连锁中央核肌病中突变的磷脂酰肌醇3-磷酸[PI(3)P] 3-磷酸酶）损害了肾小管内质网膜与早期内体之间PI(3)P依赖的接触形成，导致内质网小管转化为片层，抑制线粒体分裂和持续的氧化代谢，揭示了细胞适应波动的营养环境中早期内体-内质网接触位点在线粒体形态和功能中的作用（Jang et al., Science. 2022）。从内质网运输到高尔基体的跨膜蛋白，干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes, STING），被蛋白激酶TBK1磷酸化从而实现信号转导，STED超高分辨技术揭示了网格蛋白相关接头蛋白复合物1（AP-1）将磷酸化的STING分类到网格蛋白包被的运输囊泡中，并将其运送到内溶酶体系统以降解和终止信号传导（Liu et al., Nature. 2022）。

在神经科学领域，STED技术被广泛应用于研究神经元突触的结构和功能。例如Kedia等将培养的小鼠原代海马神经元及脑片用于观察神经元单个兴奋性突触及其区域内蛋白质的快速动态过程，评估纳米尺度的神经组织异质性，提供了对神经元结构和功能的新见解。在多种AD模型鼠的帮助下，他们发现淀粉样蛋白形成机制的主要成分（amyloid precursor protein，APP，和分泌酶）被离散地组织成局部浓度较高的纳米结构域，并且这种局部改变特征成为阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白生成的决定性因素（Kedia et al., iScience, 2021; Kedia et al., STAR Protocols, 2021）。

STED超高分辨技术还被用于研究成熟树突状细胞（dendritic cells, DCs）捕获HIV病毒，作者发现DCs的活化导致免疫球蛋白样凝集素受体CD169 （Siglec-1）在特定的质膜区域形成纳米团簇，增强了受体对携带唾液酸配体的神经节苷脂的限制性浓度的亲和力，与HIV-1颗粒或含神经节苷脂的脂质体结合后，Siglec-1纳米聚簇和以RhoA活性下降为特征的整体肌动蛋白重排增强，从而促进病毒颗粒在单个囊样间隔内的最终积累（Gutiérrez-Martínez et al., Elife, 2023）。STED还有助于理解黏着斑、紧密连接和初级纤毛的关键蛋白的排列及功能（Spiess et al., J. Cell Biol., 2018; Mangeol et al., Elife, 2022; Yang et al., Methods Mol Biol., 2016）

超高分辨显微镜可以探索微观世界的无限可能性，已经彻底改变了科学研究的方式。在细胞生物学领域，它被用于研究亚细胞结构，如微丝、微管、肌动蛋白等，细胞器如线粒体、溶酶体等，分子分布和细胞膜动态、观察蛋白质的相互作用；在神经科学领域，它可用于观察神经元的亚细胞结构和突触的细节，有助于解剖和理解神经系统的结构和功能，以及神经系统相关疾病的机制；在癌症研究领域，被用于研究癌细胞的特征、蛋白质分布以及肿瘤微环境，这对于癌症的早期诊断和治疗规划非常重要；在材料科学领域，它被用于研究纳米材料的结构和性质、帮助科学家精确控制和制备纳米结构；在药物研发领域，它可用于研究药物靶标蛋白的定位和与其他分子的相互作用，助力药物设计和筛选；在微生物领域，规避了电子显微镜无法进行活体成像等弊端，可以更加推进微生物学发展。随着未来技术的进一步发展和完善，STED将在揭示生命现象的微观机制方面展现出更大的潜力，STED技术将朝向更高的成像速度、更深的成像深度以及更广的应用范围发展。

超高分辨显微镜的成像原理基于破解传统显微镜的分辨极限，通过结构照明、图像重建和单分子成像等策略，实现对微小结构的高分辨率成像。超高分辨显微镜虽已取得了显著的应用突破，然而仍存在挑战，包括技术的精进、多模态成像、样品准备和数据分析的复杂性。

超高分辨成像技术通常需要高度复杂的设备和精密的校准，这使得其设备成本相对较高，若能降低设备成本，加上开源软件和自动化工作流程的使用，将使超高分辨成像技术更易于使用和共享。超高分辨技术通常对于三维成像和大样本的深度成像有限制，需要克服分辨率和深度之间的权衡。同时超高分辨成像的时间分辨率还可以继续提升，虽然目前SIM和MINFLUX更适合观察活细胞动态过程，但时间分辨率的提高仍然是一个挑战，特别是对于极短时间尺度的大视野或多点实时成像，能够更深入地探索微观世界并获得更多信息。在科学研究的需求下，多模态或多尺度成像将与不同的超高分辨技术相结合，例如，结合光学成像和质谱成像，从分子水平到组织水平提供生命活动更全面的信息；也可以发展高通量的样品处理和成像技术，以便更快速地获得大规模的数据。

样品准备在超高分辨成像中具有重要作用，新的标记技术和荧光探针的发展将提高成像的灵敏度和特异性，开发更友好、无损伤的样品准备方法，甚至包括无标记成像技术以减少样品标记的需求，获将更为便利。

超高分辨成像数据可能受到噪声和伪迹的影响，这需要高级的图像处理技术来减少其影响，以获得准确的图像。超高分辨成像生成的数据量大，数据存储和传输、处理和分析这些大数据需要强大的计算资源和高效的算法。深度学习和人工智能技术有望在数据分析中发挥越来越重要的作用，实现自动处理和实时解释和反馈图像数据。

总的来说，尽管超高分辨成像面临一些挑战，但其前景充满希望。未来，我们可以期待更多技术的发展，以进一步提高分辨率和扩大应用领域，如更高分辨率、更高灵敏度和更快成像速度和更大更深的成像范围。超高分辨显微镜的应用也将继续扩展到生物医学研究的各个领域，为我们解决更多重要问题，如疾病机制、药物研发、个性化医学和生态系统健康等。超高分辨显微镜技术的未来展望是光明的，它将继续推动科学研究向前迈进，揭示微观世界的微小奥秘，为改善生活质量和解决全球挑战做出贡献。