水凝胶3D细胞培养
水凝胶的血管生成实验，血管生成又称血管新生，在组织修复、生长以及在某些疾病状态如癌症中的病理改变扮演着关键角色。血管生成涉及内皮细胞的迁移、增殖与管道形成等多个步骤。 01 血管生成在生理过程中的重要作用 • 发育：在胚胎发育过程中，血管生成是形成循环系统的关键步骤； • 伤口愈合：在通过形成新的血管，为受损组织供应必需的氧气和营养物质，促进修复； • 妊娠：对于胎盘的形成和胎儿的血液供应至关重要； 02 血管生成在病理过程中的作用 • 肿瘤生长和转移 a) 肿瘤需要新血管来提供氧气和营养物质，以支持其不断增长的需求； b) 血管生成是肿瘤从原发部位扩散到身体其他部位的关键步骤； c) 逐渐出现以阻断血管生成抑制肿瘤生长和转移的新药，如贝伐珠单抗； • 糖尿病视网膜病变 a) 血管生成失控可能导致视网膜病变，是糖尿病患者常见的并发症之一； b) 使用药物抑制VEGF（血管内皮细胞标记物），可减缓病变进展； • 心血管疾病 a) 血管生成在某些心血管疾病中可能起到保护作用，如促进缺血组织的修复； b) 而在动脉粥样硬化等疾病中，异常的血管生成可能导致病情恶化； • 炎症性疾病 a) 血管生成有助于免疫细胞的运输和炎症反应的扩展； b) 抑制炎症相关的血管生成可能有助于控制某些自身免疫性疾病； • 肥胖 a) 脂肪组织的血管生成对于肥胖的发展具有重要作用； b) 抗血管生成药物可能成为治疗肥胖和代谢性疾病的潜在策略； • 眼科疾病 a) 包括年龄相关性黄斑和糖尿病视网膜病变在内的眼科疾病，血管生成的异常可能导致实力损害； • 类风湿性关节炎 a) 血管生成参与了关节炎症和软骨破坏的过程； 03 血管生成实验方法 在血管生成实验中，水凝胶通常作为细胞生长的三维基质，模拟体内环境，促进细胞的增殖和分化。常用的细胞类型为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，因其具有干细胞潜能。 • 水凝胶的作用 a) 高含水量、生物相容性、孔隙结构、可注射性、3D培养环境、动态交联、微环境构建； b) 机械性能可调：通过调整水凝胶的机械强度和韧性，可以模拟不同组织的力学特性，从而影响细胞行为； c) 刺激响应性：通过外部刺激（如光、温度、pH等）可改变水凝胶的物理状态，为细胞培养和药物释放提供控制手段； d) 生物活性配体的整合：水凝胶可整合生长因子、细胞黏附因子等，促进特定类型的细胞反应和组织再生； • 水凝胶的选择，及其优缺 a) 天然来源水凝胶：可模拟细胞外基质(ECM)的天然环境；含有胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、海藻酸盐、透明质酸等天然生物分子；通常具有较好的生物相容性和细胞亲和力； ▷优点：促进细胞粘附和增殖；支持多种细胞类型的培养；有助于细胞分化和组织形成； ▷缺点：批次间可变性较大，生物重复性差；可能存在免疫原性问题；物化特性难以控制； b) 合成水凝胶：由合成聚合物构成，如聚酯、聚乙二醇、聚酰胺、聚乙醇酸、聚乳酸等； ▷优点：高度一致性和可重复性；可以精确控制物化性能，如孔隙率、机械强度和降解速率；良好的可塑性和可调性；可通过化学改性引入特定生物活性分子； ▷缺点：缺乏天然ECM的关键特性，如细胞粘附位点；细胞相容性需通过表面修饰或添加细胞粘附分子来提高； c) 光固化水凝胶：利用光固化技术精确控制水凝胶的成型和固化过程； ▷优点：室温进行，无需化学物质或高温，对细胞友好；通过改变光源的形状和强度可实现定制水凝胶； ▷缺点：需要特定光源和设备实现光固化；光照操作可能损伤细胞活力 d) 粘弹性水凝胶：模拟体内ECM的粘弹性特性，对变形或机械负荷表现出时间依赖性； ▷优点：力学特征与细胞行为具有复杂相关性；增进对细胞-基质相互作用的理解，并指导生物材料的设计 ▷缺点：时间依赖性力学在细胞生物学中的作用尚不完全清楚； e) 微凝胶：尺寸为微米级别的水凝胶； ▷优点：可为单个或多个细胞共培养定制单个水凝胶；可组装多个载细胞的微凝胶单元构建接近类组织结构的微孔组装支架； ▷缺点：微凝胶的合成和组装具有技术难度； f) 无支架的三维细胞培养技术：不依赖固体载体； ▷优点：可以生成球体，是良好的生理模型； ▷缺点：可能存在细胞聚集体的大小和均匀性控制的挑战； • 市售水凝胶种类，及其优缺 a) 透明质酸3D水凝胶套装：Glycosil（巯基修饰透明质酸），Extralink-Lite（PEGDA，聚乙二醇双丙烯酸酯），PBS； ▷优点：良好生物相容性，支持肝细胞扩增和组织工程应用； ▷缺点：可能需要与其他ECM蛋白或肽混合以提供附着信号； b) 3D即用型3D细胞培养水凝胶：这是一种Xeno-free（无动物源成分）的多聚糖水凝胶，可室温操作； ▷优点：降低免疫原风险； c) 胶原蛋白产品：Tpe Ⅰ-A产品可快速凝胶化，有30年研究历史； ▷优点：胶原蛋白是主要组成成分，适用于需要胶原蛋白环境的细胞培养； ▷缺点：批间可变性高； d) Matrigel：含有多种ECM蛋白的基底膜基质，常用于干细胞和肿瘤细胞的培养； ▷优点：提供类似于体内环境的复杂营养和信号分子； ▷缺点：动物源成分可能导致免疫原性问题； • 水凝胶血管生成实验步骤（以Matrigel为例） a) 细胞准备：选择状态良好的HUVEC细胞，饥饿处理24h； b) 基质胶准备：提前一天晚上将Matrigel从-20℃或-80℃中取出，放入4℃冰箱解冻，同时放入一定量的枪头预冷； c) 稀释基质胶：用培养基将基质胶稀释到8-12mg/mL，根据实验需要调整浓度； d) 铺胶：将完全解冻的基质胶放至冰上，使用24孔板，每孔加入50μL（节省使用可将孔板倾斜，吸去除覆盖在底面上的胶液），将孔板放于细胞培养箱中，37℃孵育30min形成凝胶； e) 细胞传代：对HUVEC细胞消化、离心、计数，重悬在含10%FBS的培养基中，制成单细胞悬液； f) 接种细胞：每孔加入2×105个细胞，加入适量完全培养基； g) 培养观察：将板置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，2、4、6、6小时拍照观察血管网络形成； h) 定量分析：使用ImageJ分析 i) 注意事项： ▷ 选择第2代和第6代之间的HUVEC细胞，血管形成效果最好； ▷ Matrigel全程放在4℃，避免高温凝胶不可逆转； ▷ 37℃胶凝期间不要晃动孔板，避免凝胶表面不均匀； ▷ 选择的HUVEC细胞需有95%以上的细胞存活率； ▷ 细胞密度对管的形成有影响，需提前进行试验摸索最佳密度。 ▷ 以上试验操作为HUVEC的自然成管实验步骤 ▷ 若探究药物对血管生成的影响，在接种细胞步骤，将适量浓度的药物溶于完培中； ▷ 若探究不同基质水凝胶对血管生成的影响，则依据该水凝胶的刺激响应特性，使其成胶 j) HUVEC在水凝胶中成管的原因 ▷ 水凝胶提供了一个三维的、具有一定机械强度的网络结构，这与体内的细胞外基质（ECM）更为相似。HUVEC细胞在这种环境中更容易模拟体内血管的形态和功能，从而形成管状结构。 ▷ 在水凝胶中，细胞间的相互作用和信号传递更为复杂，这促进了内皮细胞间的协同作用，有利于血管样结构的形成。 ▷ 水凝胶可以包含或结合多种ECM蛋白，如胶原蛋白、纤维蛋白和层粘连蛋白等，这些蛋白可以提供促进血管生成的化学信号。 ▷ 在培养皿中，虽然也可以涂覆ECM蛋白，但其分布和浓度可能与三维水凝胶环境不同，影响细胞的行为。 ▷ 三维水凝胶环境中的细胞形态和力学传导与二维培养条件不同，这可能影响细胞内信号传导和基因表达，从而影响细胞的血管生成行为。 ▷ 在水凝胶中，细胞可以迁移并通过接触引导排列形成管状结构。 ▷ 水凝胶可以更好地模拟体内血管生成的复杂微环境，包括细胞间的相互作用、细胞与ECM的相互作用以及力学因素等。
