在做细胞生物学研究、病理毒理研究、食品检测、环境监测,以及生物医药开发过程中都会涉及到一个重要实验——细胞增殖/毒性与活力检测。
如何根据自己的实验需求进行选择呢?本篇内容带你一网打尽12种方法,盘点常用细胞活性检测方法的原理、实验步骤和各自的特点。
细胞活力检测方法
细胞活力和增殖测定的方法大致可以分为5类:细胞代谢检测、细胞计数检测、荧光染料检测、DNA合成检测、化学发光细胞活性测定。
补充:如何区分细胞增殖与细胞活性?
从概念上来看,细胞增殖一般指细胞数量的变化,进而反映出细胞的状态活性;而细胞活性是评估在特定条件下细胞是否正常生长或抑制生长的标准。
简言之:细胞活性相当于评价细胞增殖能力的基础,属于间接检测细胞增值能力的方法。因此,两者常协同使用对细胞活性进行全面评估!
一、细胞代谢检测
细胞代谢检测是细胞活性检测中最经典、应用最多的方法。
通过在细胞中添加四氮唑盐,可以进行线粒体内脱氢酶代谢活性的测定,活细胞能将四氮唑盐(如MTT、XTT、WST-1、WST-8)还原为有色的甲瓒(Formazan),再通过分光光度计或酶标仪可以进行定量检测。
▲常用代谢活性检测方法特点比较
1)CCK-8法
基于 WST-8 检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测法,主要用于细胞活性检测。
检测原理:
WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下,可被线粒体内的一些脱氢酶还原成 Formazan (橙黄色)。CCK-8 为预混溶液,即开即用。
实验步骤:
1) 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡);
2) 培养箱培养 1-4 h (避免放在培养箱边缘位置);
3) 酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
2)MTT检测法
MTT是一种黄色染料,已经普遍用于细胞增殖与毒性检测。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
检测原理:
MTT是一种可接受氢离子的化合物染料,带正电荷,具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶,而死细胞不具有此功能。
实验步骤:
▲MTT&CCK-8操作步骤对比
3)LDH测定
乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 检测试剂盒可以在细胞膜完整性丧失进而细胞浆内酶释放时检测细胞损伤。
检测原理:
在 LDH 的作用下,乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脱氢酶催化反应生成 NAD+ 和 Formazan。此方法与 CCK-8 联用可以用于死、活细胞的同步检测。
实验步骤:
直接检测法
1) 96 孔板每孔吸弃 50 μL 培养基上清,以剩余培养基及细胞作为检测对象,每孔加入 50 μL Working Solution,震荡混匀;
2) 室温避光孵育 30 min;
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution,酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。
间接检测法
1) 药物处理细胞后,从 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution,震荡混匀;
2) 室温避光孵育 30 min;
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ,酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。
▲注意:此方法需要设置高对照组,即在培养基中加入10 μL Lysis Solution。
4)Alamar Blue法
Alamar Blue试剂是另一种常用于检测细胞增殖的试剂,其不仅拥有使用方便,检测时间较短的优点,而且比CCK-8更为灵敏,同时应用广泛,可用于哺乳动物细胞、植物、细菌和真菌检测等。
检测原理:
实验步骤:
细胞准备好后直接加入Alamar Blue孵育一定时间后即可进行检测,无需自行添加任何组分,即开即用,操作简便。
二、细胞计数检测
染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法,直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力,检查细胞活性,能在光学显微镜下观察到染色结果。
1)台盼蓝染色法
检测原理:
台盼蓝(Trypan Blue),也称二胺蓝(Diamine Blue)和加拉蓝(Niagra Blue),是一种用于选择性着色死细胞和即将死亡的细胞的重要染料。这种染料不能进入细胞膜完整的细胞,而能在细胞膜受损的死细胞或即将死亡的细胞内迅速积累,从而在显微镜下显出蓝色。若染色时间过长,台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。
实验步骤:
1)制备单细胞悬液。并作适当稀释(106 细胞/ml)。
2)染色:细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。
3)计数:在三分钟内,用计数板分别计数活细胞和死细胞
结果统计:
镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力:
活细胞率(%)= 活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100
注意:
台盼蓝染细胞时,时间不宜过长。否则,部分活细胞也会着色,会干扰计数。
2)AO/PI染色法
AO(吖啶橙)/PI(碘化丙啶)染色法,是一种能够对核酸进行特异性标记的染色方法,所以可以去除红细胞等无核物质的干扰。其实原理和凋亡染色差不多,也用到了PI(碘化丙啶)。根据荧光染料的激发/发射波长,用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测即可。
实验步骤:
1)收集样本细胞,细胞数量控制在1*10^6之内。
2)PBS溶液洗涤细胞两次。
3)500ul staining buffer重悬细胞。
4)按照需要,加入5ul AO染色液或10ul PI 染色液。轻柔混匀后,避光孵育15min左右。
5)孵育完成后,PBS洗涤一次,尽快上机检测。
台盼蓝和AO/PI的对比图:
三、荧光染料检测
利用对细胞无毒性作用的荧光标记物对细胞特定结构(细胞膜、细胞质等)进行标记,标记的细胞仍保留生物学和增殖活力,通过对增殖细胞群体荧光强度的测定进而反映出细胞的增殖情况。
1)CFSE检测法
荧光染料 CFSE(CFDA-SE),是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,可以标记活体细胞。
检测原理:
CFSE 进入细胞后,可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一。在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在 488nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
检测方法:
使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光酶标仪检测。
1)建立FSC/SSC双参数散点图,排除细胞碎片,圈出淋巴细胞。
2)使用 FSC-W/FSC-A 排除黏连体。
3)CFSE/CD19 图中圈出 CD19 阳性细胞,使用CFSE 单参分别看淋巴细胞与 CD19 阳性(B 细胞)的增殖情况。
CFSE方法的优缺点:
优点
1)活体标记:可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程。
2)时间长:标记的荧光可以维持长达数周之久。
3)特定跟踪:可以与细胞亚群特定抗体结合使用。
4)稳定:进入细胞后荧光不受内环境影响。
5)结果客观:对细胞生理活动没有任何影响。
缺点
检测周期长,数据分析较复杂,不适合高通量筛选。
2)钙黄绿素Calcein AM
检测原理:
通过同时检测细胞内酯酶活性和质膜完整性,提供一种判断细胞活力的荧光染色方法。
试剂盒内含有两种染料:钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI),Calcein-AM可透过活细胞膜,通过活细胞内的酯酶作用由几乎无荧光的Calcein-AM脱去AM基团生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质Calcein(Ex/Em:495nm/515nm),因此活细胞可被检测到绿色荧光。
另一方面PI不能透过活细胞的细胞膜,但当细胞膜受损时PI可进入到死细胞内并与核酸结合,产生明亮的红色荧光(Ex/Em:535nm/617nm),因此死细胞会被检测到红色荧光。用490nm激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞;而用545nm激发时仅可观察到死细胞。
▲活细胞细胞质成绿色荧光
死细胞细胞核呈红色荧光
实验步骤:
1)将细胞接种于96孔板。根据实验需求处理细胞。然后弃去原有的培养基,用PBS洗一遍。
2)将购买的Calcein-AM和PI染色液稀释成1X,向96孔板中加入100uL的Calcein-AM和PI染色液。于37℃培养箱中孵育30分钟。如果另外需要观察细胞核的,可以用Hoechst 33342染色。
3)荧光显微镜观察。Calcein呈绿色,PI呈红色,Hoechst 33342呈蓝色。也可用荧光酶标仪进行定量检测。
3)流式细胞术
流式细胞术检测细胞活力速度快,检测的细胞数量多,结果非常准确。常应用于检测细胞增殖状态,判断细胞活性,可同时检测死亡细胞、凋亡细胞和细胞各时期的百分比。是研究不同因素对细胞周期和细胞活性影响的理想方法。
常规搭配的死活染料:
核酸结合类(7-AAD、PI、DAPI),氨基反应类(live-dead、Zombie、Fvs),以及凋亡检测试剂盒等。
▲流式细胞仪法检测结果示意图
四、化学发光法
1)ATP水平测定法
活细胞需要不断以ATP的形式输入自由能,因此通过检测ATP的增加水平可以反映出细胞增殖情况,通过采用经典的荧光素酶发光方法,可以实现高灵敏、快速、稳定的ATP检测。
ATP水平测定最具代表性的方法是CTG。
检测原理:
荧光素酶以荧光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O2 为底物,在 Mg2+ 存在时,可将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中,ATP 在一定的浓度范围内,其浓度与发光强度呈线性关系。此方法不受化合物自发荧光的影响。
实验步骤:
1) 取出细胞培养板,室温平衡 10 min;
2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 检测试剂;
3) 室温振荡混匀 2 min,以促进细胞充分裂解;
4) 室温孵育 10 min (可根据预实验结果调整孵育时间),使发光信号趋于稳定;
5) 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光测定 (检测参数可根据仪器类型及检测灵敏度适当调整)。
CTG方法的优缺点:
优点
1)简化了细胞活性检测步骤:均质的"加样-混合-检测"方案减少了其它同类检测所需的操作步骤。
2)细胞用量更少:比CCK-8的灵敏度更高,可准确地检测到低于比色法和荧光法的检测低限的细胞数。减少了每个检测反应所需的细胞数。
3)更迅速获得结果:加入试剂后10分钟就能获得数据。
4)可自行选择检测方案:可用于多种类型的多孔板操作。可用发光检测仪或CCD成像设备记录数据。
5)可连续处理培养板:发光信号稳定,样品可进行批量处理和高通量筛选。
缺点
1)价格较贵;
2)检测仪器需要带发光检测通道;
3)检测后细胞死亡。
五、DNA合成检测
细胞的增殖生长伴随着DNA的合成,因此DNA的合成可以被用来检测细胞增殖、活力及凋亡。直接检测细胞中DNA的合成,即核苷渗入法是目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法。
常用的DNA合成检测法有Brdu检测法和EdU检测法。
1)Brdu法
检测原理:
试剂盒中的EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)是一种胸苷(T)类似物,EdU可以在细胞周期的S期中替代胸苷掺入到新合成的DNA中;另一方面,EdU上的乙炔基能与叠氮化物(如荧光探针偶联Azide)通过Cu+的催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction) 。通过点击反应,新合成的DNA会被荧光标记,然后通过检测荧光信号实现细胞增殖的检测,细胞增殖越多,则荧光越强。
实验步骤:
2)EdU法
EdU是BrdU的升级版,更灵敏、更安全、更便捷。
检测原理:
EdU原理跟BrdU检测法类似,都是代替胸腺嘧啶(Thymine, T)渗入正在复制的DNA中,并加入能与Edu反应的荧光染料,即可利用检测荧光值侦测应用于细胞增殖,或在细胞组织级别作为标记追踪等研究,实验过程不需要经过BrdU检测法的DNA变性处理。
实验步骤:
EdU方法的优缺点:
优点
1)准确:标记率高且无需DNA变性(酸解、热解、酶解等),可有效避免变性带来的样品损伤,确保细胞核边缘清晰完整。
2)简单:基于小分子化学反应的检测方法,简单高效,仅需三步:EdU孵育;细胞固定;荧光检测。无需DNA变性和孵育抗体。
3)快速:无需过夜,省却抗原抗体反应。整个检测过程只需 2.5 小时。
4)安全:不使用[3H]thymidine,无放射性污染。
5)灵敏:无需抗体,检测染料仅为BrdU抗体的1/500,更容易扩散,即使单个增殖细胞也能准确检测。
6)兼容:对样品几乎无损伤,允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记,能够同时检测细胞其他性状特征。
缺点
较代谢活性检测和ATP水平测定方法来说,步骤较多,不适合高通量筛选。
总结
常见的MTT法、CCK-8法和CTG法都是基于细胞代谢活性的细胞增殖检测方法,能检测到细胞的总体增殖效果,但无法检测到单个的增殖细胞。这几种方法尽管都不是检测DNA合成的,但和EdU一样被广泛用于替代[3H]thymidine掺入法。
CFSE法基于细胞荧光示踪的原理能检测到单个的增殖细胞,通常适用于流式细胞分析。
Calcein AM/PI不是检测增殖情况的,而是能反映活死细胞的比例。
在进行细胞增殖/毒性与活力研究时,上述这些方法可以互相作为补充性检测方法。
参考文献
https://mp.weixin.qq.com/s/EQIUxVThyCkgQTuwPu4lxg
https://mp.weixin.qq.com/s/zL84yNC9s0q634ZrF_rFFQ