临床上最常用的大块颅骨缺损解决方案包括使用自体血管化骨移植、聚醚醚酮（PEEK）颅骨植入物和钛/钛合金网。然而，经过多年的临床应用，这些方法都有公认的局限性。自体血管化骨移植仍是重建大面积颅骨缺损的临床金标准。然而，它也存在一些缺点。例如，移植物形状与颅骨缺损轮廓不匹配会导致美观效果不佳。自体移植物会随着时间的推移发生大量吸收，导致轮廓不规则，需要二次翻修。此外，供体部位还会遭受剧烈疼痛和感染风险。虽然合成的 PEEK 植入物和钛网可以避免供体部位的发病率，但它们的并发症发生率很高。由于暴露和感染，经常需要将其取出，其刚性也会引起不适。此外，非降解和致密结构造成的有限骨结合也会导致植入失败。因此，对可吸收颅骨移植物的需求尚未得到满足，这种移植物可以避免供体部位的发病率以及与同种异体移植物和现有颅骨成形术材料相关的缺点。
来自南方医科大学第三附属医院的 Canjun Zeng、来自中国科学院大学温州研究院的陈世萱团队以及来自南昌大学的Wenbing Wan团队合作开发了一种混合3D打印支架，该支架由 QK 肽和 KP 肽改性而成，可有效促进内源性颅骨再生。这种混合3D打印支架由垂直排列的低温凝胶纤维组成，可在骨修复的早期阶段引导和促进细胞渗透到缺损区域。然后，共轭的 QK 肽和 KP 肽进一步调节被募集细胞的功能，促进缺损区域的血管化和成骨分化。双肽修饰混合支架的再生骨量和表面覆盖率明显高于阳性对照组。此外，与胶原海绵组相比，双肽改性混合支架能持续增强骨再生，避免骨吸收。本研究期待双肽改性混合支架的设计能为骨质再生提供一种前景广阔的策略。相关工作以题为“Aligned cryogel fibers incorporated 3D printed scaffold effectively facilitates bone regeneration by enhancing cell recruitment and function”的文章发表在2024年02月07日的国际顶级期刊《Science Advances》。
1. 创新型研究内容
在各种增材制造加工技术中，3D打印是制备骨修复材料应用最广泛的技术。然而，常规的3D打印支架（PS）的细胞播种效率较低，无法诱导细胞迁移。本研究假设在 3D PS 中引入排列整齐的纤维可进一步加速细胞渗入缺损区域，从而促进组织再生。这项工作的目的之一就是研究如何在3D PS 中引入排列整齐的纤维（图 1A）。另一个需要解决的问题是如何调控这些募集细胞的功能，如增强细胞的骨诱导能力（图 1B）。为了调节被募集细胞的细胞行为，QK 肽和 KP 肽分别被用来修饰对齐纤维和3D PS。QK 肽是一种仿血管内皮生长因子（VEGF）的工程肽，它可以促进血管生成，从而在骨愈合过程中为这些被募集的细胞提供更多营养。KP 肽是一种骨形态发生蛋白 2（BMP-2）模拟肽，可显著促进新骨形成。因此，研究人员探索了在3D PS 中引入排列纤维以及排列纤维修饰的3D PS 的细胞募集能力。此外，本研究还探讨了 QK 肽和 KP 肽共轭混合支架的促血管生成和促成骨化能力。
图1 加入 ACFs 的 3D PS 通过增强细胞募集和功能，有效促进骨再生
【含有3D PS 的 ACF 的制造和表征】
低温凝胶纤维（ACF）含有3D PS，该 PS 是通过3D生物打印结合单向冷冻铸造制备的。简而言之，使用 5 重量百分比（wt %）的明胶-甲基丙烯酰胺（Gel-MA）打印出3D晶格支架。将冻干 PS 浸入含有 0.18 重量 % Gel-MA 和 0.02 重量 % 明胶的溶液中，以形成冷凝胶纤维。然后，将浸泡过的 PS 转移到 - 80°C 的预冷不锈钢板上，进行 24 小时的单向冷冻和化学交联（图 2A）。PS 显示出无色透明的晶格结构，而 PS/ACF 显示出类似的形态，晶格孔内有一些气泡。冻干后，PS/ACFs 的孔中充满了白色纤维，与 PS 支架形成鲜明对比（图 2B）。冻干前 PS/ACFs 中气泡的存在与孔内 ACF 的形成相对应。含有3D PS 的无规冷凝胶纤维（RCF）的制备与 PS/ACF 相似，但没有单向冷冻铸造。扫描电子显微镜（SEM）图像进一步发现，与未经改性的 PS 相比，PS/ACFs 的孔中充满了纤维（俯视图），而且这些纤维呈现出垂直排列的结构（横截面）（图 2C）。PS/RCF 几乎完全被水平纤维和薄片填充。假色图像（图 2D）和方向性分布分析（图 2E）表明，形成的 ACF 具有高度一致的取向，纤维的中位角接近90°（图 2E）。形成的 RCFs 是随机的，几乎垂直于孔壁。此外，ACFs 的直径范围为 1 至 5 μm，平均直径为 2.46 ± 0.86 μm（图 2F）。
图2 不含/含 ACF 的 3D 打印支架的形态特征
【PS/ACF 的体外细胞播种效率和体内细胞募集能力】
如图 3A (i)所示，本研究将人脐带内皮细胞（HUVECs）悬浮液滴加到复水后的支架上表面并培养 2 小时，然后将播种 PS、PS/RCFs 和 PS/ACFs 的 HUVECs 转移到新鲜培养基中再培养 24 小时。3D重建共聚焦图像显示，HUVEC 只粘附在 PS 表面（深度小于 200 μm），孔洞区域没有细胞。而在 PS/RCFs 和 PS/ACFs 中，HUVEC 可粘附在 PS 和 ACFs/RCFs 区域。此外，细胞不仅分布在表面，还向下迁移到 PS/RCFs 的底部（深度约 300 μm）和 PS/ACFs 的底部（深度约 600 μm）（图 3B）。SEM 图像进一步显示，HUVEC 更喜欢附着在 RCFs/ACFs 区域，而不是 3D 打印的 Gel-MA 线区域（图 3C）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测表明，培养 24 小时后，PS/ACFs 和 PS/RCFs 上附着的细胞数是 PS 的两倍（图 3D）。
为了进一步探究PS/ACFs 的体内细胞募集能力，本研究将其植入大鼠皮下（图 3A，ii）。血红素和伊红（H&E）图像显示，植入 1 周和 2 周后，与 PS 相比，PS/ACFs 打印 Gel-MA 线的间隙中发现了更多的浸润细胞。PS/ACFs的ACFs区域新形成的组织密度明显高于PS的空白区域，而且PS和PS/ACFs周围没有形成纤维囊（图3E至G）。此外，本研究还通过三色染色法观察了新形成组织的细胞外基质（ECM）形态。三色染色图像发现，PS 组的 ECM 纤维方向是随机排列的。相比之下，PS/ACFs 组的 ECM 纤维排列有序（图 3H），其中包括 ACFs 的方向。假彩色图像和角度定量分析进一步证实，与 PS 组相比，PS/ACFs 组的胶原纤维方向高度一致（图 3H 和 I）。此外，本研究还发现在皮下植入 PS/ACFs 1 周和 2 周后，PS/ACFs 组的血管生成情况优于 PS 组。
图3 含有3D PS 的 ACFs 的体外细胞播种效率和体内细胞募集能力
【KP 肽功能化 PS 的促成骨细胞特性】
本研究还利用裸鼠皮下异位成骨模型探讨了 PS-KP 的促成骨作用。将 rBMSCs 悬浮液滴在支架表面共培养 24 小时，然后将负载 PS-KP 的 rBMSCs 皮下植入裸鼠体内（图 4A）。离体支架组织的显微计算机断层扫描（Micro-CT）3D重建图像显示，手术 4 周后，PS-KP500 组有明显的新骨形成，而 PS、PS-KP250 和 PS-KP750 组几乎没有新骨形成（图 4B）。轴位、矢状位和冠状位图像显示了再生骨的分布和形态。PS-KP500 组的再生骨呈现出与 PS 形态一致的晶格形状（图 4C）。与 PS、PS-KP250 和 PS-KP750 组相比，PS-KP500 组的再生骨体积（BV/TV，%）、骨表面（BS/TS，%）、骨小梁数（Tb.N，1/100 mm）和厚度（Tb.Th，μm）的定量分析结果明显增加（图 4D 至 G）。三色染色（图 4H）和 H&E 染色显示，PS-KP500 组的类骨基质最多，呈块状分布。PS-KP750 和 PS-KP250 组有少量类骨基质。PS 组几乎没有检测到类骨基质。免疫组化染色显示，PS-KP500 组和 PS-KP750 组的 OPN 表达高于 PS 组和 PS-KP250 组。PS-KP500 组的 OPN 表达也高于 PS-KP750 组（图 4I 和 J）。因此，本研究确定了500 μg/ml 的KP 肽是修饰 3D 打印 Gel-MA 水凝胶的有效浓度。
图4 KP 肽功能化 PS 的促成骨细胞特性
【QK 肽功能化 PS/ACF 的促血管生成特性】
如图 5A所示，本研究将不同浓度（100、300 和 500 μg/ml）的 QK 肽与 ACFs 共轭，并将不同的 PS/ACFs-QK 皮下植入，以验证 PS/ACFs-QK 的促血管生成性能。扫描电子显微镜图像、假彩色图像和角度分布分析表明，ACFs-QK100、ACFs-QK300 和 ACFs-QK500 组的低温凝胶纤维垂直排列。术后 2 周，本研究将皮下植入的支架与周围组织分离。三色染色结果表明，随着 QK 肽浓度从 0 μg/ml 到 500 μg/ml 的增加，新形成的血管逐渐增多（图 5B 和 C）。免疫组化染色和半定量分析进一步表明，与 PS 组和 PS/ACFs-QK100 组相比，PS/ACFs-QK300 组和 PS/ACFs-QK500 组新生血管的面积有所增加。PS/ACFs-QK500 组新生血管的面积高于 PS/ACFs-QK300 组（图 5D 和 E）。因此，本研究确定500 μg/ml浓度的 QK 肽是修饰 ACFs 的有效浓度。
图5 QK 肽功能化 PS/ACF 的促血管生成特性
【KP 肽和 QK 肽功能化 PS/ACF 在大鼠临界大小颅骨缺损模型中的骨促进再生能力】
为了验证 KP 肽和 QK 肽功能化 PS/ACFs 潜在的骨促进再生能力，本研究将 PS-KP500/ACFs-QK500 植入大鼠临界大小的颅骨缺损（直径 8 mm）中，并以商用胶原海绵作为阳性对照（图 6A）。X 射线图像（图 6B）和重建 Micro-CT 图像（图 6C 和 D）显示，手术 4 周和 8 周后，PS-KP500/ACFs-QK500 组和胶原海绵组的新骨形成明显多于对照组。定量分析进一步显示，治疗 4 周后，PS-KP500/ACFs-QK500 组和胶原海绵组的再生骨量（BV/TV，%）和表面覆盖率（%）没有差异。而在治疗 8 周后，KP500/ACFs-QK500 组的再生骨量（BV/TV，%）和表面覆盖率（%）均高于胶原组（图 6E 和 F）。
图6 KP 肽和 QK 肽功能化 PS/ACFs 在大鼠临界颅骨缺损模型中的骨促进再生能力
组织学观察显示，治疗 4 周后，PS-KP500/ACFs-QK500 组和胶原蛋白海绵组检测到更多的有机再生骨基质，这与重建的 Micro-CT 图像一致（图 7A 和 B）。本研究发现，对照组和海绵胶原组缺损区新形成的胶原纤维均平行于颅骨表面（箭头方向）。在 PS-KP500/ACFs-QK500 组中，本研究发现了一部分垂直排列的胶原纤维，这是由 ACFs 引入的。一些脱钙的有机骨基质在垂直排列的胶原纤维内形成（箭头方向）（图 7B）。本研究进一步分析了位于伤口边缘和中间的胶原纤维的排列方向。对照组和海绵胶原组的胶原组织呈水平排列，而 PS-KP500/ACFs-QK500 组的胶原纤维呈垂直排列（图 7C 至 F）。治疗 8 周后，H&E 和三色染色显示术后 8 周缺损区有更多新形成的有机骨基质（图 8A 和 B）。免疫组化染色（图 8C）和半定量分析显示，PS-KP500/ACFs-QK500 组的 CD31、骨钙素（OCN）、骨生长因子（OPN）和RUNX2的相对表达量是三组中最高的（图 8D 至 G）。
图7 治疗 4 周后的骨再生组织学观察
图8 治疗 8 周后的骨再生组织学观察
2. 总结与展望
本研究报道了一种混合3D PS，它对 QK 肽和 KP 肽进行了修饰，可有效促进内源性颅骨再生。混合3D PS 由垂直 ACF 组成，可在骨修复的早期阶段引导和促进细胞渗透到缺损区域。然后，共轭的 QK 肽和 KP 肽进一步调节被募集细胞的功能，促进缺损区域的血管化和成骨分化。植入 8 周后，双肽改性混合支架的再生骨量和表面覆盖率明显高于阳性对照组（海绵胶原）。此外，与海绵胶原组相比，双肽改性混合支架在 4 至 8 周内持续增强了骨再生能力。本研究团队预计，引入 ACFs 并结合功能肽的策略将启发下一代生物材料的设计，从而有效实现高质量的内源性骨再生。
文章来源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk6722
