2024年6月7日，浙江大学林世贤实验室（博士后丁文龙、博士生于微和博士后陈宇霖为论文共同第一作者）在 Science 期刊发表了题为：Rare codon recoding for efficient noncanonical amino acid incorporation in mammalian cells 的研究论文。
非天然氨基酸重组蛋白的翻译效率太低，发展了20多年，因为效率极大限制了使用；研究找到了非天然氨基酸和天然编码的结合点，有效解决效率低，产业化潜力巨大。
进一步问，为什么该团队能做出这项工作？因为近20年的研究，研究者都是以终止密码子或者特别密码子展开；为什么不能从第一性原理出发，天然密码子也能实现非天然氨基酸插入呢？
展开林教授的系列研究，清晰看到一条研究路线，开创了融合体系、迭代升级、天然突破的“三板斧”，一步步打破现有体系实现了里程碑的突破；
1.第一步新型融合体系，部分元件天然化
林世贤实验室发明了一种基于嵌合体设计的蛋白质工程改造新方法。通过嫁接吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对的正交元件到天然aaRS/tRNA对上，将后者改造成为具有广谱正交性的系统。论文开发了4种全新的、在原核生物和真核生物都适用的嵌合体aaRS/tRNA对，并证明嵌合体系统具有较好的催化活性。
在深入的理解了吡咯赖氨酸 aaRS/tRNA广谱正交性原理的基础上，研究人员提出嵌合设计策略-将吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对中的独特的正交结构元件直接嫁接到天然氨基酸aaRS/tRNA对上，从而实现天然氨基酸aaRS/tRNA对的正交化。
通过对PDB数据库中天然氨基酸aaRS/tRNA三维结构的分析，研究者设计并构建了17种嵌合aaRS/tRNA对。然后利用绿色荧光蛋白琥珀密码子插入实验对嵌合体活性进行测试，得到了8对有活性的嵌合体。进一步优化嵌合设计和表达调控元件，结合tRNA的工程进化，最终开发出了4个活性较高且具有广谱正交性的嵌合aaRS/tRNA对，分别为：嵌合体组氨酸系统、嵌合体苯丙氨酸系统、嵌合体丝氨酸系统和嵌合体丙氨酸系统。
Nat Comm | 林世贤团队报道嵌合体翻译系统的开发及其应用
2. 定向进化，大幅提升翻译效率
对嵌合体苯丙氨酸tRNA的受体茎进行了定向进化，以野生型 (WT)-chPheT 为例，从chPheT受体茎的第二到第七个碱基对开始，碱基被随机分配到所有可能的组合中，生成约 1.7 × 107个变体的文库，最终筛选到3C11-chPheT为活性最高的突变体，UAA插入效率比WT-chPheT高4-6.7倍，并且在真核生物中也可以正交。接下来，作者对嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA 合成酶chPheRS进行了定向进化，经过四轮定向进化筛选了超过130,000个克隆，得到两个优势克隆，12D4-chPheRS和13E3-chPheRS。之后作者对嵌合体翻译系统的活性进行验证，以GFP为reporter，证明筛选得到的嵌合体翻译系统能够实现各种UAA的高效单点插入，其插入效率与天然氨基酸相似并且具有高保真度，在4-叠氮基-Phe (AzF) 或3-苯并噻吩基-Ala (BTA) 存在下，chPheRS/chPheT的琥珀抑制效率（信噪比）分别提高了65.3倍和22.9 倍，后续作者也验证了该系统在多位点插入系统中的高效性。作者还构建了UAA依赖性的合成大肠杆菌菌株，这些菌株的生长严格依赖于外源供应的UAA，最后作者将该嵌合系统在活体小鼠中进行应用，合成的营养缺陷型大肠杆菌在补充了UAA的小鼠中生长旺盛，证明了这种进化的嵌合Phe系统在体内的应用性。
Nat. Commun. | 定向进化嵌合翻译系统以实现高效非天然氨基酸插入
3. 自然之力，大模型助力非天然体系
基于之前的基础，利用稀缺的天然密码子，结合强大的正交翻译体系可以打造全新的翻译机器。
非天然氨基酸的低效率编码是翻译释放因子的强劲竞争所致。因此可通过使用有义密码子替换终止密码子用于编码非天然氨基酸，来规避翻译释放因子的竞争。
通过分析所有61种有义密码子的使用频率和内源解码tRNA丰度，筛选出7种具有重编码潜力的稀有密码子，并通过系列实验，确定了最具重编码潜力的稀有密码子。
随后，研究者优化了TCG重编码系统在哺乳动物细胞中的非天然氨基酸编码效率，实现以接近天然氨基酸的编码效率表达系列带有非天然氨基酸的功能蛋白质。研究者同时证明在TCG重编码系统工作时，表达体系的宿主细胞能够维持正常的转录、翻译和增殖等功能。
