BD Multitest™ 6-color TBNK试剂与可选的BD Trucount™试管是一种用于BD FACSCanto™和BD FACSCanto™ II流式细胞仪的六色直接免疫荧光试剂，用于识别和确定外周血中T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的百分比和绝对计数，以及T细胞的CD4和CD8亚群。BD Multitest 6-color TBNK试剂和BD Trucount试管可以与BD FACS™ Loader一起使用。

根据生物学功能和细胞表面抗原表达，人类淋巴细胞可以分为三个主要亚群人群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞（CD16+CD56+）。BD Multitest™ 6-Color TBNK可与或不使用BD Trucount™试管一起用于表征这些淋巴细胞亚群人群。

●当试剂与BD Trucount™试管一起使用时，流式细胞仪特定的BD软件使用BD Trucount™珠和样本的流动数据计算淋巴细胞亚群百分比和绝对计数。

●当试剂不使用BD Trucount™试管时，流式细胞仪特定的BD软件直接从样本流动数据计算淋巴细胞亚群百分比。如果您输入来自另一台仪器或方法获得的淋巴细胞数据，软件也可以计算绝对计数。

确定CD3+CD4+淋巴细胞的百分比或计数对于监测感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的个体非常有用。HIV感染者通常在感染进展过程中表现出CD3+CD4+淋巴细胞计数的稳定下降。CD3+CD4+百分比或计数以及总T和B淋巴细胞用于表征和监测某些免疫缺陷和自身免疫疾病。已确定为CD3–和CD16+和/或CD56+的NK淋巴细胞已被证实对某些肿瘤和病毒感染细胞介导细胞毒性。NK介导的细胞毒性不需要目标细胞上存在I类或II类主要组织相容性复合物（MHC）分子。

当全血加入试剂时，试剂中的荧光标记抗体会特异性结合到白细胞表面抗原上。在采集过程中，细胞经过激光束并散射激光。染色细胞会发出荧光。仪器检测到的这些散射和荧光信号提供有关细胞大小、内部复杂性和相对荧光强度的信息。

BD Multitest™ 试剂采用荧光触发，允许直接对淋巴细胞群体进行荧光门控，以减少门控中未溶解或核化红细胞的污染。当使用BD Trucount™试管时，在BD Trucount™试管中直接对样品进行染色，样品体积精确。试管中的冻干颗粒溶解，释放出已知数量的荧光珠。在分析过程中，通过比较细胞事件和珠事件，可以确定样本中经门控的细胞的绝对数量（细胞/µL）。如果使用适当的流式细胞仪特定BD软件（参考下表），软件将确定绝对计数。如果使用诸如BD CellQuest™ Pro软件之类的软件手动进行数据分析，只需将阳性细胞事件数除以珠事件数，然后乘以每个冻干颗粒中的BD Trucount™荧光珠数量除以样品体积（µL）。

推荐的BD系统

a.进行日常的细胞分析仪质量控制

b.来计算补偿。

C.设置光电倍增管(PMT)电压和荧光补偿，使用前检查仪器灵敏度

BD Multitest™ 6-Color TBNK包含以下成分：

● FITC标记的CD3，克隆SK7

●PE标记的CD16，克隆B73.1，和PE标记的CD56，克隆NCAM16.2

● PerCP-Cy5.5标记的CD45，克隆2D1（HLe-1）

●PE-Cy7标记的CD4，克隆SK3

● APC标记的CD19，克隆SJ25C1

● APC-Cy7标记的CD8，克隆SK1

偶联抗体的浓度值

CD3与CD3抗原/T细胞抗原受体（TCR）复合物的ε链作用。CD3抗原存在于正常外周血淋巴细胞的61%至85%。CD16和CD56共同有助于识别NK淋巴细胞群体。CD16识别一个50至70kD）的人类NK淋巴细胞抗原，是IgG的Fc受体。CD16在不同程度上与粒细胞反应。CD56识别一个外细胞区域的类免疫球蛋白结构域，常见于神经细胞粘附分子（NCAM）的三种分子量形式（120、140和180 kDa）。CD45识别180到220 kDa的人类白细胞抗原，属于T200家族的成员。CD45抗原存在于所有人类白细胞中，包括外周血中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。CD45抗体据报道与成熟循环红细胞和血小板反应较弱。CD423抗原，55 kDa，存在于一个T淋巴细胞亚群（CD3+CD4+），占正常外周血淋巴细胞的28%至58%。CD4抗原在单核细胞表面的细胞密度较低，并存在于单核细胞的胞质中。CD19识别一个90 kDa的抗原，存在于人类B淋巴细胞上。CD19抗原存在于人类外周血淋巴细胞的大约7%至23%和脾细胞上。CD19抗原存在于人类B淋巴细胞在所有成熟阶段。CD19不与静息或活化的T淋巴细胞、粒细胞或单核细胞反应。CD8抗原以与二硫键连接的32 kDa α亚基形式表达为二聚体复合物。CD8抗原存在于T淋巴细胞亚群以及NK淋巴细胞亚群上。CD8抗原在正常外周血淋巴细胞的表达率为19%至48%，在正常胸腺细胞中的表达率为60%至85%。CD3、CD16、CD45、CD19、CD4和CD8抗体由鼠IgG1重链和κ轻链组成。CD56抗体由鼠IgG2b重链和κ轻链组成。

▲如果观察到试剂外观有任何变化，请勿使用。沉淀或变色表明试剂不稳定或已恶化。

▲抗体试剂含有做为防腐剂的偏硝基苯三唑。请注意避免微生物污染，这可能导致错误的结果。

▲如果使用BD Trucount™ 管，请校准移液器以准确吸取50 µL样本。建议按照移液器制造商的说明执行反向吸液技术。

▲BD Trucount™ 管的珠子计数因批次而异。在将此值输入软件或手动计算绝对计数时，使用当前批次BD Trucount™ 管上显示的珠子计数非常重要。建议不要在同一次运行中混合多个管子批次。

▲ BD Trucount™ 管设计用于特定的裂解/无洗程序。不要尝试在前向散射（FSC）上设置阈值进行数据收集。

▲请勿使用先前固定和存储的患者标本。在染色前冷藏的全血样本可能会产生异常结果。来自服用免疫抑制药物的患者的样本可能会产生分辨率低的结果。爆发细胞可能会干扰测试结果。溶血样本应该被拒绝。

▲请勿将BD Trucount™ 控制品与制备的BD Multitest™ 6-Color TBNK样本一起使用。BD Trucount™ 控制珠子可能会干扰绝对计数结果。

▲ 谨慎保护管子免受直接光照。在室温（20°C–25°C）下进行程序。

▲前往regdocs.bd.com下载安全数据表。

警告：所有与生物标本和接触的材料均被视为生物危险物质。请以适当的预防措施处理具有传染性的生物标本和材料。永远不要用嘴吸取移液。穿适当的防护服、眼镜和手套。已报道固定可以使HIV失活。

▲将试剂储存于2°C至8°C。已打开或未打开的试管中的试剂在试管标签上显示的有效期内是稳定的。不要在有效期后使用试剂。

▲不要在存储或与细胞孵育过程中冷冻试剂，也不要直接暴露在光线下。保持试剂试管干燥。

▲如果将试剂放置在BD FACSDuet™仪器中每天8小时，连续5天，试剂是稳定的。不要在仪器中过夜存放试剂。放置在BD FACSDuet™仪器中5天后剩余的任何试剂必须由用户进行验证。

▲将BD Trucount™试管存放在原始铝箔袋中，温度在2°C至25°C。为避免潜在的冷凝，只有在达到室温后才打开袋子，并在取出试管后立即仔细重新封好袋子。每次打开袋子时检查干燥剂。如果干燥剂从蓝色变为淡紫色，丢弃剩余的试管。从铝箔袋中取出试管后1小时内使用。一旦袋子被打开，试管可以稳定保存1个月。不要超过包装上标明的过期日期使用。

BD Multitest™ 6-Color TBNK和BD Trucount™ Tubes设计用于配备适当计算机硬件和软件的流式细胞仪上使用。推荐使用表中列出的BD系统进行细胞计数仪的设置、采集和分析。有关详细信息，请查看相应的试剂和细胞计数仪使用说明书（IFU）。BD FACS™ Loader和BD FACS™ Universal Loader可与此产品一起使用。有关您使用的装载器的细胞计数仪的IFU，请查看更多信息。BD FACSDuet™样品制备系统可与此产品一起使用。有关更多信息，请查看BD FACSLyric™流式细胞计数仪与集成BDFACSDuet™样品制备系统使用说明书。确保仪器在使用前正确设置并通过每日质量控制。

使用指定的软件：

●使用BDTrucount™ Tubes自动计算淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数

●使用12×75毫米聚苯乙烯管自动计算淋巴细胞亚群的百分比，或者输入从另一台仪器或方法获取的淋巴细胞数据，以便软件除了计算淋巴细胞亚群的百分比外还能计算绝对计数。

①　血液采集管或等效物。BD Multitest™ 6-Color TBNK和BD Trucount™ Tubes已经通过EDTA血液采集管进行验证。

②　此程序需要至少100微升全血。遵循采集管制造商的指南，确保采集到足够的血量以保证样本的正确稀释，特别是在使用BD Trucount™ beads进行绝对计数时。

③　室温（20°C至25°C）下保存的抗凝血液必须在采集后24小时内染色，并且必须在染色后6小时内进行分析。

BDMultitest™ 6-Color TBNK 每个试管中含有1毫升缓冲盐水和0.1%偶氮甲烷的试剂，按照指示使用时可进行50次测试。如果要计算绝对计数，请订购带有BDTrucount™ Tubes的BD Multitest™ 6-Color TBNK。试剂附带两个BDTrucount™ Tubes的袋子。每个袋子包含25支试管，足够进行25次测试。BD Trucount™ Tubes中包含一支单次使用管中的冻干荧光珠。

▲对于BDFACSLyric™流式细胞计数仪：

①　BD®CS&T Beads（目录号662413, 662414）

②　BD®FC Beads 7-Color Kit（目录号662961）

▲对于BDFACSCanto™和BD FACSCanto™ II流式细胞计数仪

①　BD FACS™ 7-Color Setup Beads（目录号335775）

②　BDFACS™ 溶解溶液（目录号349202），BD FACS™ 溶解溶液含有二乙二醇和甲醛，请查看BD FACS™ 溶解溶液IFU以获取注意事项和警告

③　试剂级（蒸馏或去离子）水

④　BDVacutainer® EDTA血液采集管或等效物

⑤　一次性12×75毫米Falcon®聚苯乙烯管或等效物（如果不使用BD Trucount™ Tubes）

⑥　振荡器

⑦　带有提示的微量移液器

⑧　用于分配1X BD FACS™ 溶解溶液的大容量分配器或移液器（450微升）

⑨　可溶解的全血处理控制，例如，- BD Multi-Check™ Control（目录号349700, 349701, 349702）- BD Multi-Check™ CD4 Low Control（目录号349703, 349704, 349705）

1. 稀释BD FACS™ 溶解溶液

将10倍浓缩液与室温（20°C–25°C）去离子水按1:10稀释。制备的溶液在室温下存放在玻璃或高密度聚乙烯（HDPE）容器中，稳定可保存1个月；

2. 进行反向移液

在使用BD Trucount™ Tube时，准确的移液至关重要。建议使用反向移液技术将样品加入BD Trucount™ Tube中。对于反向移液，按下按钮到第二个停止位置。释放按钮以将多余的样品吸入管尖。按下按钮到第一个停止位置以排出精确体积的样品，将多余的样品留在管尖中。

3. 执行质量控制

根据美国病理学家学院（CAP）的指导方针，建议运行两个级别的液体控制材料（过程控制）。控制应该在每天进行患者测试的日子至少运行一次。使用商业控制品，每次运行时提供已建立的百分比阳性和绝对计数值，以评估系统性能。BD提供BD Multi-Check™ Control和BD MultiCheck™ CD4 Low Control作为过程控制使用。

①　充分混合适当的BD Multi-Check™ Control或等效的过程控制品。查看控制品的IFU以获取详细说明。

②　使用BD Multitest™ 6-Color TBNK染色控制样品，如下一节所述。

③　 控制样品应该像患者样品一样处理，以监测整个分析过程的持续性能。

④　在流式细胞计数仪上获取染色的控制样品。

⑤　目测检查CD45 vs SSC点图。

⑥　淋巴细胞群应呈现出明亮、紧凑的簇，具有低SSC。

⑦　单核细胞和粒细胞也应呈现为明显的簇。

⑧　如果各群体分散且簇之间几乎没有分离，请不要继续分析。

⑨　确保结果在检测数值表中报告的数值范围内。

4. 细胞染色

①　对于每个患者样本，使用样本标识号标记一个12×75毫米的管子。对于绝对计数，使用BD Trucount™ 管而不是12×75毫米的管子。注意在使用BD Trucount™ 管之前，验证BD Trucount™ 珠子团是否完整且位于管子底部的金属固定器内。如果情况不符，请丢弃BD Trucount™ 管并替换为另一个。不要将珠子转移到另一个管子中。

②　向管子底部加入20 µL的BD Multitest™ 6-Color TBNK。如果使用BD Trucount™ 管，将试剂滴在管子侧面，刚好在金属固定器上方，避免触及珠子。

③　向管子底部加入50 µL混匀的抗凝全血。注意如果使用BD Trucount™ 管，建议使用反向吸液技术将样本滴在管子侧面，刚好在金属固定器上方。避免将血涂抹在管子侧面。如果全血留在管子侧面，它将不会被试剂染色，可能影响结果。

④　盖上盖子并轻轻振荡混合。在室温（20°C–25°C）暗处孵育15-30分钟。

⑤　向管子中加入450 µL的1X BD FACS™ 溶血溶液。

⑥　盖上盖子并轻轻振荡混合。在室温（20°C–25°C）暗处孵育15-30分钟。

⑦　样本现在准备好在流式细胞仪上分析。如果染色后不立即分析样本，请将其存放在室温（20°C–25°C）的暗处。

5. 获取样本

①　以低速彻底振荡细胞。在运行样本之前，减少聚集是非常重要的。意如果使用装载器，请将管子放入装载器架之前立即振荡管子。

②　安装管子到细胞仪并获取样本。在获取样本之前，调整阈值以最小化碎片并确保包含感兴趣的细胞群。

③　使用适当的细胞仪特定软件分析数据。查看细胞仪的IFU获取更多信息。

当使用细胞仪特异性BD软件时，结果显示阳性细胞占淋巴细胞的百分比。如果使用BD Trucount™ 管，或者如果血液学结果来自另一台仪器或方法，软件还会计算每微升血液中的阳性细胞数（绝对计数）。

1. 计算绝对计数

单平台方法：当使用BD Trucount™ 管时，可以通过比较细胞事件和珠子事件来确定样本中阳性细胞的绝对数量（细胞/µL）。

细胞仪特定的BD软件使用以下公式计算绝对计数：

*此值可在 BD Trucount 管箔袋标签上找到，并且可能因批次而异

双平台方法：在使用12×75毫米聚苯乙烯管（或等效管子）而不是BD Trucount™ 管时，要让软件计算绝对计数，用户需要输入绝对淋巴细胞计数，或绝对白细胞（WBC）计数和淋巴细胞百分比，该百分比由血液学分析仪器或其他方式确定。软件使用以下公式之一进行计算：

①　用户提供每微升的绝对淋巴细胞计数

②　用户提供每μL的白细胞计数和淋巴细胞的百分比。

注意：使用 Dual 确定的绝对计数的准确性平台方法取决于输入值的准确性软件。