白金会员
蛋白免疫印迹即Western Blot的基本原理是通过对凝胶电泳分离的细胞或生物组织样品的抗原与抗体特异性反应进行着色，通过分析着色条带的位置和着色深度获得目的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。
Western blot 的主要过程是经由PAGE ( 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) 分离的蛋白质样品，转移到固相载体(NC膜，PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的蛋白的大小和表达量。
Western Blot 的实验方案概括如下：
1. 样本制备和定量：使用组织/细胞裂解液提取总蛋白质。蛋白质提取应注意低温操作防止蛋白失活，需要加入蛋白酶抑制剂放在蛋白降解，磷酸化检测样本还需加入磷酸酶抑制剂。
２.SDS-PAGE 胶制备：根据不同分子量的蛋白选择不同浓度的分离胶，自制胶确保没有气泡，不漏胶和上样孔平整，也可以直接使用预制胶。
3. 电泳跑胶：使用电泳根据大小/重量分离蛋白质分子，浓缩胶使用低电压（80V）达到浓缩效果，分离胶使用高电压（120V）快速分离蛋白分子。
4. 转膜：将蛋白质分子转移到固体膜上。不同大小的蛋白质转膜时间不同，大分子转膜时间长，小分子转膜时间短。
5. 封闭：一般会使用脱脂奶粉和BSA进行非特异性蛋白和背景的封闭。
5. 抗体孵育：一抗，二抗孵育，通过标记物实现目标蛋白可视化。抗体的稀释液，浓度，孵育时间和温度会直接影响孵育效果。
6. 洗膜：洗去未结合的抗体，膜洗涤不彻底会影响结果观察。
7. 结果观察： 成像系统检测到感兴趣的目的蛋白质，观察目的蛋白大小是否符合预期。
为了让大家更直观地了解Western Blot 的实验操作流程，biorbyt 小编带来了WB实验操作的详细视频。
第一期：SDS-PAGE 胶的配制