qPCR（Quantitative Real-time qPCR）是实时荧光定量PCR的简称，是指使用实时荧光PCR仪，对整个PCR反应扩增过程进行实时的检测并记录其荧光信号。随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度的实时监测，实现对目的基因进行定量分析。

做完qPCR，如何判断最后数据是否可靠，能不能用？要不要重新来？

这个问题对经常做的来说可能不是问题，但是对于新手来说是一个小问题。

一般来说，在qPCR数据分析中，判断数据是否可靠主要依据以下几个方面：

判断依据1，扩增曲线

扩增曲线（Amplification curve）：在反应进行过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标，生成扩增曲线。

理论上PCR过程中反应产物是以指数增长的，但随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反应副产物阻碍反应等原因，致使PCR的扩增效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，因此扩增曲线是一条“S形”曲线。

扩增曲线可以分成四个时期：基线期，指数期，线性期，平台期。

理想的扩增曲线应该呈现出典型的 S 型曲线，起始时没有扩增，起峰时间正常，并能达到平台期。且曲线应该平滑，没有明显的锯齿状。

常见问题及解决方案

判断依据2，Ct值在合理范围内

Ct值的定义：PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

Ct值是判断实验成功与否的重要参考。CT值应该在合理的范围内，一般来说，CT 值应该在 15-35 之间，且复孔间的曲线重复性好。

过大或者过小都不太好，过大可能是一些阴性扩增；过小则浓度过大，可对模板进行适当的稀释。

如果实验中使用了内参基因，内参基因一般小于20，并且样品间内参的Ct值差不超过1，表明内参基因表达量稳定。目的基因Ct值一般是大于内参基因Ct值。

判断依据3，溶解曲线

紧接着就要看溶解曲线了（一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一）。

熔解曲线（Melt curve）是以反应温度为横坐标，以荧光信号负一次导数（dR/dT）为纵坐标，反映温度与DNA双链解链程度变化的曲线。

熔解曲线是判断qPCR检测中是否具有非特异性扩增的重要指标。溶解曲线应该呈现单峰，峰的宽度较小，这表明扩增是具有特异性的。如果出现多个峰或非特异性扩增，数据可能不可用。

正常的溶解曲线TM（DNA双链解链50%的温度）在75-90之间，有一个平滑尖锐的单峰，无杂峰，如果峰距在5个TM内就更好了。如果溶解曲线不对，那么Ct再好都要重来。

下面是异常的溶解曲线▼

熔解曲线主峰前有杂峰，可能原因：存在比目的片段短的非特异性片段，也有引物二聚体的可能，此种情况下可尝试提高退火温度、降低引物浓度、重新设计引物等方法解决。

熔解曲线主峰后有杂峰，可能原因：大多由非特异性扩增引起，存在比目的片段长的非特异性片段。可通过调整稀释倍数、减少引物等来进行调整。

判断依据4，标准曲线

通常用标准品按照倍比稀释成至少5个浓度梯度，以起始拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标，生成标准曲线，建立Ct值和拷贝数之间的线性关系。

标准曲线的线性范围应当涵盖所有实验样本的浓度范围。标准曲线的R²值应接近1，通常要求R² ≥ 0.99。

根据标准曲线的一些参数可以判断荧光定量 PCR 体系的优劣。

斜率：标准曲线的斜率代表荧光定量 PCR的扩增效率，理论值为-3.32，表示扩增效率为100%，PCR产物的量在每个循环增加一倍。

扩增效率低于100%，其原因可能是PCR反应性能较差，包括引物、试剂和反应条件等不适宜，也可能是标准品稀释不准确。

扩增效率高于100%，表明反应体系中可能存在抑制因素，主要包括模板质量较差，模板浓度过高等。有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率过高，需要通过熔解曲线进一步验证分析。

PCR反应中并不是每个循环中的模板均能实现了完美倍增，一般PCR扩增效率在90%~110%之间（即每个循环的扩增倍数应在1.8到2.2之间，对应斜率范围-3.58~-3.10），都可以用于数据分析哦。

如果 qPCR 数据满足以上要求，则一般可以认为数据可用。如果数据存在异常或不符合要求，则需要进一步分析原因并采取相应的措施，如优化实验条件、重新实验等。