什么是流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
目录
流式细胞术 - 概述
流式细胞术 - 简介
流式细胞术 - 原理
流式细胞术 - 应用
流式细胞术 - 信号测定
流式细胞术 - 抗体染色
流式细胞术 - 概述
一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术，是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展，为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求，流式细胞技术仍然在快速发展，并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。
流式细胞术 - 简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式细胞仪检测单个微粒（单细胞悬液、生物颗粒等）的多项特性或对特定群体加以分选的一门技术，具有快速、准确、客观的特点，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪（Flow Cytometer）是以流式细胞术为理论基础，集流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机为一体的一种新型高科技仪器，可对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析。
流式细胞术 - 原理
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞术 - 应用
细胞生物学研究
流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲线。例如，在测定Hela细胞DNA含量分布曲线上，第一个峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/静止期）细胞,其次一个峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期＋有丝分裂期)细胞，从2C～4C间的区域为S期（DNA合成期）细胞。采用绘图法或计算机拟合法可计算出细胞周期各时相细胞占整个细胞群体的百分数。
用流式细胞术可进行多参数分析，即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光，或多种不同颜色的荧光。例如细胞经吖啶橙染色后，DNA发绿色荧光，RNA发红色荧光。测定这两种荧光就能同时得知一个细胞内的DNA和RNA含量。测定结果可用二维散点图或三维立体图表示。用这种方法可根据DNA和RNA含量而鉴别出G0与G1、M期和 G2期细胞。用流式细胞术与液体闪烁技术相配合,还可求得细胞通过G1、S和G2+M期的时间(T、Ts、T+M及其变异系数。近年利用抗溴脱氧尿苷(Brdurd)单克隆抗体能发现渗入到细胞 DNA内的溴脱氧尿苷。将此种荧光抗体技术与测定细胞 DNA含量相结合，是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期，鉴别死细胞和活细胞，利用荧光标记配体，还可定量测定细胞表面和内部的受体等。
遗传学研究
用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。
免疫学研究
结合免疫荧光方法，流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞，例如用荧光素标记的免疫球蛋白鉴别T和B淋巴细胞（图3），根据细胞表面抗原的不同,进一步分辨出不同的T和B淋巴细胞亚群，以及测定每个细胞所带抗原的数量、密度及其动力学参数等。也可用流式细胞分选技术将带有“＋”和不带有“－”的某种特异抗原的细胞群体分类收集，供研究其功能特性。
流式细胞术对于判断免疫缺陷症，如爱滋病（获得性免疫缺损综合征）的重要特征，即T4和T8淋巴细胞比例改变（T4细胞大量减少）以及判断自身免疫病和确定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素，测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度，结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目，以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。
肿瘤学研究
肿瘤细胞一般都含有异常数量的 DNA。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞，由于流式细胞术样品制备方法简单，测定结果精确，能快速得到有关DNA倍性的信息,因而能提供有价值的诊断数据。如果在测量 DNA含量的同时，再测定其他参数（如不同类型的中等纤维蛋白，蛋白质含量、细胞大小、核质比等）则可进一步提高诊断的可靠性。
流式细胞术可在实验和临床中评价肿瘤化疗和放疗的作用，现在根据流式细胞术和细胞动力学数据来监视肿瘤治疗的工作已经在实际工作中开展起来。
此外，流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展
流式细胞术 - 信号测定
当带荧光的细胞通过激光束时，会随着时间产生发射光峰或脉冲。它们将被 PMT 检测并转换成电压脉冲，这就是事件。流式细胞仪会检测总脉冲高度和面积，并将测得的电压脉冲直接与该事件的荧光强度相关联。
图1：PMT 将检测荧光细胞每次释放的光子产生的电压脉冲面积。
当没有荧光标记的细胞通过光学元件时，不会发射光子，也不会检测到信号。当荧光标记的细胞通过光学元件时，会受到激光照射并发射光子，因此检测到的电压强度会逐渐增强。随着荧光细胞逐渐通过激光束，会随着时间变化产生一段电压脉冲。
通过积分各时刻脉冲的高度值得到脉冲面积，这由模数转换器 (ADC) 的速度决定，也就是 10 MHz（即每秒 1000 万次或每微秒 10 次）。
依据事件的脉冲强度（脉冲面积）为事件分配通道。增大通过 PMT 的电压可以对信号进行放大。
图2：利用通道号和事件数绘制的单参数直方图。
X 轴为用对数表示的通道。
根据测得的信号强度为每一事件分配通道号；荧光强度越高，事件的通道号就越大。
图3：阴性和阳性结果的荧光强度测定值。
左侧的阴性结果表明没有染色的细胞且各事件的荧光强度都很低，右侧的阳性结果表明存在大量荧光强度很高的事件。
在阳性结果中，可以看出阴性对照和阳性样品间强度结果有所不同（图 :4）。
图4：人PBMC 细胞对单核细胞设门的抗-CCR2 抗体 (ab21667) 染色结果。
流式细胞术 - 抗体染色
1、直接染色：
在直接免疫荧光染色中，将细胞与直接偶联到荧光染料（如 FITC）的抗体一同培养。该染色法仅需一步抗体培养，且消除了二抗的非特异性结合。
对于包含二抗的大型抗体 - 荧光染料复合物可能被捕获而导致非特异性结合或无法进入细胞防止一抗检测的细胞内染色非常适用。
2、间接染色：
在间接染色中，一抗未用荧光标记，而是通过荧光标记的二抗进行检测。第二种试剂可以是能与一抗特异性结合的抗体。此外，还可使用亲和素 - 生物素体系，这种方法将抗体偶联到生物素上，再通过荧光染料标记的亲和素进行检测。
由于目前可用的偶联抗体种类很多，这种方法可以将多种不同靶标产生的未偶联一抗用于与荧光标记的二抗结合，以进行 FACS 分析。这大大提高了研究人员的可选靶标蛋白范围。
3、细胞内染色：
用于流式细胞术的细胞内抗原染色方案取决于可让抗体接近内部细胞蛋白的固定和透化方法。无论何种情况，成功的染色都离不开通过抗体滴定进行的实验条件优化、使用适合的对照正确设置流式细胞仪以及优化的固定和透化步骤。
4、分泌蛋白的检测：
分泌蛋白的检测十分困难，因为蛋白会在检测前从细胞中释放出来且可能快速降解。高尔基体阻断剂（如布雷非德菌素A）可用于抑制表达蛋白的分泌，使其仍保留在高尔基体中。然后再用细胞内染色法检测靶标蛋白。
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