英文题目：In-depth urinary and exosome proteome profiling analysis identifies novel biomarkers for diabetic kidney disease中文题目：深入的尿液和尿液外泌体蛋白质组分析可识别糖尿病肾病的新型生物标志物发表期刊：Science China-Life SciencesDOI:10.1007/s11427-022-2348-0糖尿病肾病(DKD)是2型糖尿病(T2DM)的主要微血管并发症，可导致不可逆的肾脏损害和预后不良。对于T2DM患者，尤其是病程较长的患者，早期监测和筛查肾损伤是必要的。目前糖尿肾病临床的诊断主要指标包括尿微量白蛋白、肾小球滤过率等，但这些指标在实际应用时仍具一定局限，比如易受不同生理/病理状态影响，部分值在一些患者中可逆转为正常值。因此由于目前诊断指标的特异性和敏感性有限，急需开发新型高准确性、高特异性的生物标志物来实现DKD的精准诊断，实现精准治疗及预后。研究收集144例临床患者尿液样品进行蛋白质组检测，其中健康对照HC 19例，糖尿病DM 125例（DM1期74例，DM2 36例，DM3 15例）。随着DKD的进展，eGFR（肾小球滤过率）值降低，ACR（白蛋白/肌酐比值）和糖尿病病程从DM1到DM3显著增加。在DKD进展过程中发现的蛋白质较少，DM1组中鉴定到的蛋白最多，DM3组最少（图1B）。所有样品中均鉴定的蛋白为730种（图1C），部分蛋白是各组特有的，表明随着DKD进展会发生独特的生物学变化。亚细胞定位预测到质膜、细胞核、细胞质、胞外及高尔基体等蛋白，暗示尿液蛋白质组检测鉴定的深度和无偏倚性（图1D）。蛋白强度跨越了9个数量级，进一步表明尿液蛋白质组鉴定的深度（图1F）。PCA显示DM3与其他组别，DM2与DM1、HC均可明显区分，而DM1和HC无法较好分开，与临床表型一致（图1G）。除此之外，白蛋白与所有样品临床的ACR水平高度相关，但同每组的相关性较低，尤其是DKD早期阶段，甚至不相关，表明白蛋白可能不是DKD早期诊断完美的单一生物标志物。对DKD进展的不同阶段进行了时间序列聚类分析，揭示HC、DM间蛋白的动态变化。在DKD不同阶段，所有蛋白的表达模式被分为6个簇（图2A），并对每个簇的蛋白进行了GO富集及亚细胞定位分析（图2B, C）。其中，簇2包含白蛋白，随着DKD的进展表达逐渐增加，在DM3时达到峰值；簇2蛋白与脂质转运和胆固醇酯化、转运等代谢过程相关。在6种表达模式中，簇2蛋白的表达模式与肾功能下降导致的滤过障碍最为匹配。因此研究将其与ACR进行相关性分析，选择相关性最高的蛋白（图2D），最终发现ALB，IGHG2，TF，SERPINA1，MYO5A五种蛋白质的表达水平随DKD进展而显著增加（图2E）。此后，研究对HC和DM组样品进行了差异表达分析，HC与DM1组间得到552个显著差异表达蛋白（图3A）。KEGG富集分析显示，差异蛋白主要参与蛋白质消化吸收、糖酵解、碳代谢及抗原加工和呈递通路（图3B），表明免疫应答在糖尿病状态下被激活。为了进一步评估DKD的诊断能力，使用k最近邻(kNN)方法分析了超过50%样品中定量的226种蛋白质。简单地说，将144个样本按的比例随机分为训练组和试验组7:3。当k=3时，模型的错误率最低。通过ROC曲线，以显示HC、DM单个蛋白的诊断效率，其中14种蛋白的曲线下面积(AUC)≥0.65，说明训练组和试验组对DM有较好的诊断准确性和特异性。然后，选择AUC＞0.8的前3个蛋白，与之前的14个蛋白具有相似的诊断准确性和特异性，作为候选生物标志物（图3A, B）。与HC相比，这三种蛋白(PAM、TOPBP1和IGHV11B)在DKD疾病中均有差异表达，且从DM1到DM3几乎呈线性增加（图3E-G）。除此之外，研究也对DKD不同阶段的差异表达蛋白进行了分析，DM1 vs HC、DM2 vs DM1、DM3 vs DM2分别得到460、582和320个差异蛋白（DAPs），这些DAPs间有59个共有蛋白（图4A-D）。对共有蛋白进行聚类分析，热图显示它们可能是明确区分HC和DKD不同阶段的明显特征（图4E），暗示DAPs具有进行疾病诊断的潜力。接着通过kNN及ROC曲线分析，筛选出CTSD、sFRP4和CD300E三种蛋白（AUC值均大于0.6）作为潜在的生物标志物（图5F-H）。144份尿液样品中，44份用于外泌体蛋白质组检测。和尿液蛋白质组数据相比，二者共同鉴定出1097个蛋白质，而外泌体中鉴定出375个独特的蛋白质。PCA显示DM3也能与其他组有效分离（图5A），与尿液样品的蛋白数据一致。所有外泌体蛋白的表达模式被分为6个簇（图5C）。同样HC和DM1样品进行差异分析获得了325个差异表达的外泌体蛋白（图5D）。通过将DM中显著上调的外泌体蛋白与ACR密切相关的蛋白质比较，发现了五种共有蛋白，它们随着DKD的进展显著增加（图5E，F）。之后通过kNN方法和ROC分析简化了潜在的生物标志物，发现AFM和TF（AUC＞0.8）可以预测HC和DM（图5G，H）。研究也对DKD不同阶段差异表达的尿液外泌体蛋白进行了分析，DM1 vs HC、DM2 vs DM1、DM3 vs DM2分别得到87、179、398个差异蛋白（图6A-C），这些DAPs间有6个共有蛋白（图6D）。其中，血管紧张素转换酶(ACE2)蛋白在DM1中的表达显着高于HC，而在DM2和DM3中的表达显着降低。DPP4、MAN2B2和SERPINI1在DM1中的表达显著低于HC，而在DM2和DM3中的表达显著增加。PODXL蛋白在DM1中的表达与在HC中的表达相似，但在DM2和DM3中的表达明显高于HC。这些差异表达的蛋白质是潜在的DKD伴随诊断的外泌体生物标志物。为了验证上述蛋白作为DKD生物标志物的潜力，研究另外收集了42份临床尿液样品，对筛选出的潜在生物标志物蛋白进行WB验证，最终证实了TF，SERPINA1，CTSD和AFM四种蛋白可作为DKD生物标志物。TF，SERPINA1和AFM随着DKD的进展而增加，而CTSD从DM1到DM3降低。糖尿病肾病(DKD)是2型糖尿病(T2DM)的主要微血管并发症，早期监测和诊断疾病进展对治疗DKD起着至关重要的作用。本研究中对DKD患者进行了大规模的蛋白质组检测，发现DKD患者一系列潜在的生物标志物，如SERPINA1、TF、CTSD、AFM被检测并证实可用于DKD诊断或疾病监测。研究全面阐明了尿液蛋白组的动态变化，揭示了几个潜在反映DKD进展的生物标志物，为DKD生物标志物的筛选提供了参考。
