你是否了解Realtime-PCR和qPCR实验呢？说到Realtime-PCR和qPCR，有很多同学还是分不清。其实Realtime-PCR和qPCR是同一个实验，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。在这里我们也简单介绍一下RT-PCR和Real-time PCR的区别吧。Real-time RT-PCR中间的“RT”是 reverse transcription（逆转录），整个意思就是利用 mRNA 或 总RNA 为模板的实时逆转录PCR技术（quantitative Real-time RT-PCR）。Real time RT-PCR指的是 qPCR+RT-PCR的组合，是说将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析，因为RT-PCR是可以定性的，但不能进行定量检测的。同时，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR）。所以不难理解 Real-time RT-PCR（RT-qPCR）就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从 RNA 反转录得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。所以，实时荧光定量PCR，它不仅可以用cDNA作为模板，也可以用基因组DNA等作为模板。
1.1 PCR技术发展历程
（1） 1983年
1983年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制。
（2） 1985年
1985年，Cetus公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermus aquaticus）株中纯化出耐热DNA聚合酶（后面简称Taq 酶）。该酶耐高温的性质极大地提高了PCR扩增的效率，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。但是PCR技术也有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这一问题Russ Higuchi进行了一系列相关研究。
（3）1992年
1992年，Higuchi在一次报告中提出了实时荧光定量PCR技术。通过检测溴化乙锭的含量实时监控整个PCR反应的进程。之后经过不断地研究，通过对PCR反应的数学函数关系、相应的算法以及对标准品的运用，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。
（4）1996年
1996年ABI公司推出世界上第一台定量PCR仪7700型。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对结果进行分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。由此，实时荧光PCR技术开始更广泛地应用。
1.2 PCR仪器发展历程
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3.1 荧光定量PCR流程图
首先确定课题的研究目的，对照组，重复组（注：生物学重复和技术重复是2个概念）以及实验条件。
在样本制备这里不做过多讲解，有需要的研究僧可以回顾一下这方面的内容：
（4）逆转录反应
在样本制备这里不做过多讲解，有需要的研究僧可以回顾一下这方面的内容：实时荧光PCR技术主要是基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1~10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。提到实时荧光PCR技术，首先映入你脑海的是不是TaqMan探针方法和SYBR Green染料方法？其实，实时荧光PCR技术比你想象地更丰富。下面就让我们一起领略荧光定量PCR精彩的世界吧！！！
SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。
<2> TaqMan探针法类型
<2.1> 水解探针（常用）
扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术目前应用较为广泛，包括人或动物病原体检测、生物制品鉴定等领域。
双杂交探针(dual hybridization probe)实时荧光PCR就是在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团，两基团的激发光光谱有一定程度的重叠。对两条探针的要求是，其与靶核酸的杂交位置应相互邻近。当两条探针与靶基因同时杂交时，两个荧光基团靠得很近，其间的距离在1~10 nm(通常为1~5个碱基)，依据FRET原理，在供体基团一定波长的激发光作用下，发生能量传递，从而激发受体基团发射另一种荧光，荧光强度和PCR反应中DNA合成量成正比。由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光，因此，该方法的特异性增强。
<2.3> 分子信标
分子信标(molecular beacon, MB)探针由两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子组成，分子信标的环部分和靶核酸互补，而探针的两头由于互补而成为茎。当分子信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从而抑制报告基团产生荧光。在PCR变性阶段，该探针的茎部打开形成一条单链，当溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5'端荧光基团和3'端淬灭基团分离，荧光信号得以释放。该方法可以用于基因定量分析、疾病基因检测和诊断等。
蝎型探针（Scorpions Probes）由探针、引物以及PCR终止子组成。探针部分和分子信标相似，也是5'端有一个荧光基团，3'端有一个淬灭基团，并且呈现茎环结构，与分子信标所不同的是，蝎形探针带有一段特异引物，可与相应的靶核酸结合，在Taq DNA聚合酶的作用下聚合延伸，得到扩增产物，而所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序列杂交结合，因此，如有扩增存在，在不断变性复性过程中，蝎形探针即可不断与扩增子杂交，茎环结构打开，荧光基团不再被淬灭而被发射出来，荧光强度与扩增产物的含量呈正比。蝎形探针中特异探针序列呈环状结构，由一个不可扩增的单体即PCR终止子连接于PCR引物的5'端，PCR终止子可防止扩增蝎形探针的茎环部分。以上探针类型是目前科研生物行业比较常用的。还有一些比较特殊的探针有小凹槽结合剂（MGB）探针、Amplifluor检测探针、LUX探针、QZyme探针和LocNA探针。如果有想详细了解这些探针的基本作用和有有缺点，可参考《qPCR简明技术手册》。
<3> SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别
（6）引物设计
4.1 扩增曲线和溶解曲线常见术语
• Ct值可信区间：15-35
• Ct<15扩增一般处于基线期
• Ct=35相当于起始拷贝数为1
• Ct值却极具重现性
• Ct值只与起始模板量相关
• 每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系：起始拷贝数越多，Ct值越小。
标准曲线：
溶解曲线：
4.2 如何判断qPCR是否准确可信
通过扩增曲线、线性度-吻合度、线性范围-稀释梯度、灵敏度、特异性和重复度，判断qPCR的结果。
4.3 相对定量和绝对定量的区别
4.4 相对定量结果解读
相对定量：是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异，也就是倍数差异。可通过阅读这篇文章可完全了解相对定量结果解读，复制链接搜索即可：
https://zhuanlan.zhihu.com/p/586973078
4.5 绝对定量结果解读
绝对定量：用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。绝对定量需要已知浓度的模板来建立标准曲线。绝对定量在我们的实验中不常用，所以只简单介绍一下。是通过样品的CT 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。(1) 将标准品稀释成不同浓度，作为模板进行扩增；(2) 以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标绘制标准曲线；(3) 根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中获得样品的拷贝数。
标准品（Standard）
在GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中注明标准样品的组分需要与被测样品组分一致。标准品既可以是含有目的基因的线性化质粒DNA，也可以是比目的基因扩增片段长的纯化后的PCR产物，或者基因组DNA和cDNA，但是需要作为标准品的核酸必须保证稳定并且需要精准定量。并且由于核酸提取、逆转录等实验过程可能会影响反应结果，所以需要注意标准品的实验步骤应与实验样品尽可能相同。常用标准品包括：DNA标准品：纯化的PCR扩增片段或含有目的基因的克隆质粒。
目前市面上，有各种各样的染料法qPCR试剂，我们该如何选择一款适用于我们的qPCR仪器，又能满足我们qPCR实验的试剂呢？首先，在选择qPCR试剂前，我们要明确课题的研究目的，是用于做检测呢？还是看基因的表达量？其次，在通过判断qPCR仪器（不同仪器有的需要ROX染料、Low ROX染料、High ROX染料进行校正，有的不需要），选择合适的qPCR试剂。最后，进行实验验证qPCR产品的的扩增效率、扩增曲线、灵敏性、特异性、稳定性等性能。这样才能很好挑到合适又实用的qPCR产品，同时最主要的还是考虑性价比，毕竟做科研真的很耗经费。小编通过实践验证，推荐以下几款产品，供大家选择参考：染料法qPCR试剂是采用SYBR Green I 嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR的专用2×浓度预混液。含有优化浓度的Fast HSTaq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg 2+、反应缓冲液和稳定剂等成分。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测。Fast HSTaq DNA Polymerase 高温加热前，抗Taq单克隆抗体与Taq结合，抑制Taq的聚合酶活性，从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板DNA非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增。抗体在PCR反应的预变性步骤中已完全失活，不会阻碍之后Taq酶聚合反应，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。优化浓度的SYBR Green I 荧光染料掺入DNA双链后，荧光信号增强，而不掺入链中SYBR Green I染料分子荧光信号不变， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光可以在退火或延伸阶段测定。
GenStar 2×RealStar Fast染料法qPCR预混液，货号：A301
探针法qPCR试剂是专用于探针法（TaqMan，Molecular Beacon等）实时荧光定量的预混体系。产品含有优化浓度的Fast HSTaq DNA Polymerase、dNTPs、Mg 2+、反应缓冲液和稳定剂等成分。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA 靶序列的检测，如基因表达分析，拷贝数分析，SNP基因型分析等，适用于不同类型探针法荧光定量PCR。Fast HSTaq DNA Polymerase高温加热前，抗Taq单克隆抗体与Taq酶结合，抑制Taq酶的聚合酶活性，从而抑制在低温条件下出现的由引物和 模板DNA非特异性扩增或引物二聚体引起的非特异性扩增。抗Taq单克隆抗体在PCR反应第一循环的变性步骤中已完全失活， 不会阻碍之后的Taq Polymerase反应，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。
GenStar 2×RealStar Fast探针法qPCR预混液，货号：A351
一步法RT-qPCR试剂是qPCR+RT-PCR的组合，是说将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析。如果想减少实验步骤，节省时间，又是做RNA模板的小编建议使用一步法RT-qPCR，既省时又提高实验效率。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对或以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同,但不是单一PCR的简单混合，常受到反应体系和反应条件的各种因素影响。
多重qPCR也是在一管内完成多个目标基因的检测，要区分这些目标基因的荧光信号，通过SYBR Green I染料标记扩增产物就无法实现，因此常用探针法来进行多重qPCR，即针对每一个目标基因，设计特异性探针，利用不同探针上标记的荧光基团，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。同样的多重RT-qPCR也是类似原理。如果有小伙伴做诊断试剂盒的话，小编一般会推荐多重qPCR试剂和多重RT-qPCR试剂。
随着PCR技术的不断改进和发展，qPCR已经成为了分子生物学研究的重要工具之一。以下是qPCR应用发展的一些方面：（1）定量基因表达分析：qPCR可以用于测量特定基因在不同样本中的表达水平，从而可以研究基因的调控机制和功能。（2）病原体检测：qPCR可以用于检测病原体的存在和数量，例如病毒、细菌和真菌等。（3）遗传变异检测：qPCR可以用于检测单核苷酸多态性（SNP）和基因重复等遗传变异，从而可以研究遗传疾病的发病机制和个体差异。（4）分子诊断：qPCR可以用于检测某些疾病的分子标志物，例如肿瘤标志物和心血管疾病标志物等，从而可以提高疾病的早期诊断和治疗效果。（5）环境监测：qPCR可以用于检测环境中的微生物群落和生物多样性，例如水体、土壤和空气等，从而可以研究环境污染和生态系统的变化。总之，qPCR在基础和应用研究中具有广泛的应用前景，可以为生命科学领域的研究和临床诊断提供重要的技术支持。
Q2：请问进行相对定量检测前提供组织样本时需要将组织块定量吗？
A2：不需要，采用qPCR相对定量法主要是以表达量稳定的内参基因作为对照从而判断目的基因相对表达丰度。我们在实验操作中会对各个环节进行把控，确保实验结果的客观性：
1）组织抽提的RNA会进行定量；
2）正式上机前对样本进行RT-PCR检测确定反应条件；
3）上机检测后的相对定量数据分析，计算每个样本目的基因对相对稳定的内参基因的表达差异，可以排除上样量的差别对数据分析的影响。
Q3：可以进行miRNA的荧光定量PCR检测服务吗？与编码基因的qPCR操作流程上有何区别？
A3：可以，采用专用的miRNA荧光定量PCR试剂盒即可。与编码基因的qPCR检测流程上的主要区别是需要将提取后的RNA，用poly(A) 聚合酶在其3’末端加尾，再用5’端带40nt延伸序列的单碱基锚定Oligo-dT引物进行反转录，得到约80nt的cDNA，然后用特异引物进行SYBR Green实时定量PCR扩增。其中miRNA的引物设计需要大量摸索，才能获得重复性高可信度高的数据。
Q4：如何制备绝对定量 PCR 的标准品？
A4：将欲定量基因的一小段序列（200-300bp）克隆到T载体上，经测序验证后，进行小量抽提，采用分光光度计定量，按照公式计算拷贝数后梯度稀释，用于上机绘制标准曲线，从而计算待检测基因的拷贝数多少。
Q5：荧光定量PCR有哪些注意要点？
A5：荧光定量PCR的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作，抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.8-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高，进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现，尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外，还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定，退火温度在55-65°C之间。除此之外，其他各个环节如试剂的稳定性，RNA反转的质量好坏，PCR上机条件的设定，加样的手法和熟练度等等也要注意。
Q6：荧光定量PCR引物的设计原则是什么？
A：
1）扩增产物长度在80-200bp；引物应在核酸序列保守区内设计并有特异性；引物通常设计为跨内含子。
2）产物不能形成二级结构；引物长度在18-30bp之间，其中碱基应随机分布；待扩增的片段Tm值应在55-65°C之间；待扩增的片段GC含量在40-60%之间；引物自身及引物之间不能有连续4个碱基的互补。
3）引物5′端可进行修饰，3′端不能进行修饰；引物3′端要避开密码子的第3位。
Q7：如何设计荧光定量PCR的TaqMan探针？
A7：TaqMan探针的设计原则为尽量靠近上游引物；长度一般为30-45bp，Tm 值至少比扩增引物高 5° C；5′端不能为 G，因为 G 会淬灭荧光，从而影响定量；设计时，需要通过软件来进行设计，网络上有许多免费的以及在线的设计软件可以使用。
Q8：可否设计羊源、猪源等其他物种基因的qPCR引物？
A8：可以设计，但对于人，大鼠，小鼠常规模式生物以外的基因（由于无法在NCBI获得完整的基因序列信息），在进行PCR优化的时候难度远远大于常规生物基因，周期会增加，且可能需设计多对引物才可能获得满意的实验结果。
Q9：判断扩增曲线是否良好的指标有哪些？
A9：
1）曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。
2）曲线指数期斜率与扩增率成正比，斜率越大扩增效率越高。
3）标准的基线平直或者略微下降，无明显的上扬趋势。
4）各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。
Q10：扩增效率太低 (<90%)是什么原因呢？
A10：
高GC或含复杂二级结构、存在抑制PCR反应的物质、引物加入量过高、引物设计不合理、扩增子太长。2）尽量避免二级结构：可用GeneQuest等软件检测扩增片段单链是否形成二级结构。3）存在PCR抑制物：稀释模板，再纯化模板，或使用相应抑制剂。5）重新设计新的引物：引物长度一般在 15-30 碱基之间,GC含量在 40%-60%之间6）减小扩增子长度：80-300bp（100-150bp）7）仪器允许可使用白色qPCR耗材+透光度好的封板膜
（1）非特异扩增
1）熔解曲线分析，单峰还是多峰
2）琼脂糖电泳分析，是否为引物二聚体，存在则减少引物的用量。
（2）引物二聚体
重新设计引物，引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免引物二聚体的形成。1）增加扩增子长度，相同条件下，片段越小，理论扩增效率越高；若扩增子长度小于80bp，结果有受到引物二聚体影响的风险，扩增效率则极可能超过110%；
2）非特异性扩增
3）试剂及环境污染
环境出现污染可用核酸清除剂清除污染物！！！
Q12：出现基因组DNA污染？
A12：
A14：可能的原因是试剂中的参比荧光染料 ROX 浓度与仪器机型不匹配导致的 Badrox，往往出现在需要高浓度 ROX 校正的 ABI 7900HT、StepOne 等仪器上。可在「Setup」中进行设置，将「Passive Reference」的「ROX」调整为「None」，扩增曲线即恢复正常。曲线恢复正常后，该数据是否能够采用还需根据复孔重复性进一步判断。
