ibidi血管生成实验|节省90%基质胶!消除凹液面!
ibidi血管生成载玻片具有无凹液面，节省基质胶，成像效果好等特点，为血管生成实验提供完整解决方案。
血管生成实验介绍
当内皮细胞被接种到类似基底膜的表面上（例如Matrigel®.），它们在体外形成类似毛细血管的结构，从而重现了血管生成过程。
管道形成实验可以提供关于特定物质的促血管生成或抑制血管生成效应的见解。该实验首先通过接种单个细胞，然后观察和成像随时间而变的管道形成，可获取多种可读取的结果（例如，管道长度和环数）。术语“管道”描述了形成网状中可见的细胞束。它不特指这些细胞束是否具有腔道。通常情况下，管道会在几小时内形成，使管道形成实验成为血管生成定量的快速工具。
本应用说明是一个逐步的操作步骤，诠释了在Matrigel®上使用内皮细胞（人脐静脉内皮细胞，HUVECs）进行管道形成实验，使用的是ibidi µ-Slide 15 well 3D (15孔3D/血管生成载玻片)。μ-Slide具有独特的几何结构，可轻松、便捷和可重复的进行管道形成实验。我们设计的是一种“孔中孔”的嵌套式几何形状，每孔仅需10 µl的凝胶，无凝胶弯液面形成。该设计确保在统一厚度的凝胶基质上形成的所有细胞均位于同一光学平面，从而创建可重复的细胞培养条件和高质量的相差显微镜或荧光显微镜图像。
“孔中孔”的设计避免了弯液面的形成
对于高通量的成管分析可使用ibidi μ-Plate 96 Well 3D，更多详情可点击查看“Tube Formation Assay in the µ-Plate 96 Well 3D”。
•人脐静脉内皮细胞（HUVEC，C-12203，PromoCell） • 胶原蛋白IV（354233，康宁） • 0.05 M HCl（X942.1，Carl Roth） • 内皮细胞生长培养基（PromoCell，C-22010） • PBS（14190144，Gibco） • Accutase（A1110501，Gibco） • Matrigel®生长因子降低，不含酚红（Corning®#356231），每孔10µl • 可选：Calcein AM（PromoKine，PK-CA707-80011） • µ-Slide 15well 15孔3D载玻片，ibiTreat底部处理 (81506, ibidi) • µ-Slide Rack载玻片支架 (80003, ibidi) • 用于检查最佳凝胶量的刻度纸刻度纸 • 冰和冷却架 • 标准细胞培养设备(移液器，无菌工作台，细胞培养箱，培养瓶，血细胞仪等) • 可选: 多通道移液器 • 倒置显微镜（可选荧光和用于钙黄绿素染色的适当过滤器组） 请在无菌条件下执行以下步骤 重要提示：始终使用预冷移液头(4°C)移液凝胶! 1.在实验前一天，将Matrigel®放在4°C的冰箱中，使胶能过夜缓慢融。 2.在实验当天，将Matrigel®放置在层流罩的冷却架上。 在层流罩中放置一个µ-Slide Rack载玻片支架。从无菌包装中取出µ-Slide 15 Well 3D，并将其放在µ-Slider Rack上。 4. 将刻度纸放入µ-Slide下方，以便调节容量。确保载玻片和孔之间的距离约为1-2cm。 5.每孔中加入10 μl 凝胶。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入凝胶，这样可防止有凝胶流经上孔。 在µ-Slide 15 well 3D的每个内孔上涂抹10µl凝胶。将移液管尖端竖直地保持在井的中间。这样可以防止凝胶流入上部井中。 6.盖上µ-Slide载玻片的盖子。 移液凝胶的重要注意事项： 始终使用预冷移液头(4°C)移液凝胶。为了避免凝胶中出现气泡，请确保在填充之前正确混合Matrigel®溶液。用移液管上下移动三次(10µl)，同时将移液管尖端留在凝胶中。 调整凝胶体积 具有平坦表面的无弯液面凝胶对于最佳成像至关重要。为了实现这一点，每个内孔的凝胶体积需要精确为10µl。由于Matrigel®的高粘度，可能需要将移液器调整至大于或小于10 µl。为了控制凝胶的量，将载玻片放置在刻度纸上方1-2厘米处（在µ-Slide Rack载玻片架上），并通过填充的孔观察刻度纸。体积正好为10 µl时，没有放大或最小化效应。如果刻度纸的网格减少，则需要增加移液体积。如果网格被放大，则必须减小移液体积。 1.准备一个培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒作为额外的湿度室。 2.将µ-Slide载玻片放入培养皿中，盖上培养皿的盖子。 3.将整个培养皿放入培养箱中进行聚合(30-60分钟)。 4.同时，准备细胞悬液。 凝胶表面的细胞数量是获得试管形成试验可靠结果的关键参数。细胞类型和大小决定细胞播种数量，必须在开始一系列实验之前进行优化。 在使用μ -Slide 15 Well 3D, ibiTreat之前，请阅读使用说明。在无菌条件下进行所有步骤。在开始实验之前，在标准细胞培养瓶中制备HUVECs（例如T75，用6.7µg/ml胶原IV在0.05M HCl中包被1小时)制备，细胞粘附在底部。在实验当天，细胞应该是健康的和最佳的低融合。 在整个过程中迅速工作是很重要的，这样孔中就不会干涸。 如未另行说明，所有给定体积均为每孔的体积，所有培养步骤均在室温下进行。 1.用Accutase处理培养的HUVECs 1-2分钟使其脱离。 2.收取细胞悬液，离心，用少量培养基稀释计数; 数量取决于所需的细胞浓度。 3.数一下细胞。计数应尽可能准确，并始终以相同的方式在所有孔中具有相同数量的细胞。当每孔的最终细胞数为10,000个细胞时，在培养基中将其调节至最终浓度为2 x 105个细胞/ml。 4.从培养箱中取出带有凝胶的µ-Slide 15 Well 3D，并将其放在µ-Slide Rack支架上。 5.在将细胞悬浮液加入孔中之前，通过上下数次移液将其充分混合。在每个上孔中加入50µl。移液器尖端保持直立，注意不要用移液器尖端接触凝胶胶。对于这一步，多通道移液器可能会有所帮助。 使用多通道移液器将细胞移液到µ-Slide 15 Well 3D中 6.用随附的盖子盖上µ-Slide载玻片。可选：ibiSeal 22 x 48（10872）（更多详情可点击查看），一种自粘密封膜，可用于覆盖孔，用于弯液面平坦化和改进的相位对比显微镜。 7.µ-Slide 15 Well 3D现在可以进行观测了。几分钟后，细胞下沉到凝胶表面。管开始形成，并且可以在一个焦平面中成像，而不会干扰凝胶弯液面。可选：为更好地观察导管，可在成像前进行钙黄蛋白染色。 如果需要使用荧光显微镜观察，可以使用钙黄蛋白对活细胞进行染色。在试管形成后，遵循以下步骤: • 染色前，对细胞进行成像。这提供了染色前后细胞模式的比较，以检测可能发生的任何染色伪影。 • 每孔制备50µl钙黄绿素溶液：将37.5µl无血清细胞培养基和12.5µm钙黄绿元（1µg/µl原液）混合，最终浓度为6.25µg/ml（1:160）。 • 用移液器小心移除上清液。注意不要损坏凝胶或细胞网格。 • 将钙黄绿素溶液加入孔中。在室温下在黑暗中培养30分钟。 • 用PBS轻轻清洗3次。慢慢地用PBS冲洗上孔的侧面。不要将其直接移到细胞上。相反，把它从孔的另一边移走，这样它就能温和地冲洗细胞。 • 使用倒置荧光显微镜在485/529 nm处对细胞进行成像。 可以使用亮场、相位对比或荧光显微镜对管的形成进行成像（例如，当用活细胞染料如钙黄绿素染色时，见上面（4. 可选：Calcein Staining钙黄绿素染色））。显微镜上的数据采集可以手动或自动进行。 特别是在第一次进行实验时，我们建议录制延时视频，以确定时间相关性和曲线特性（例如，最大和稳定相位）。在后续实验中，单次手动测量通常足以研究物质对管形成的影响。 活细胞成像装置中的自动图像采集是收集试管形成分析数据的最方便和可重复的方法。ibidi Stage Top培养箱适用于所有标准倒置显微镜，包括CO2/O2控制及主动控制湿度。细胞接种后，立即将µ-Slide玻片放入倒置显微镜上的培养室中。选择您想要观察的部分，然后开始延时录制。对于HUVECs，我们建议放大4倍或10倍，单个图像之间的时间间隔为5分钟。使用软件自动对焦程序，可以随着时间的推移获得清晰的图像。请记住，细胞可以迁移到凝胶中，并随着时间的推移改变焦平面。 10倍物镜的相位对比图像(5x6单幅图像的排列)，显示了μ -Slide 15孔3D(直径4mm)的整个孔，HUVECs在播种10小时后形成了细胞网格。 如果你知道网格形成的曲线，那么只在感兴趣的点收集图像就足够了。培养时，将载玻片放在培养箱内的湿度室内，然后在不同的时间点取出载玻片，在显微镜上手动采集图像。 µ-Slide 15 Well 3D中使用HUVECs的管形成分析的延时图像。细胞接种后0小时、2小时和4小时，用10x物镜进行相位对比显微镜检查。 为了量化管的形成，可以基于不同的参数来分析图像，例如管的长度、环、细胞覆盖面积或分支点。这可以使用图像处理软件（例如ImageJ）或使用自动分析软件（例如Wimasis、ACAS或FastTrack）手动执行。 自动图像分析，管形成前（左）和后（右）
