免疫荧光实验方案 ibidi µ-Slide VI 0.4
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。传统实验方法用小玻片，先泡酸、再晾干、再 coating、再种细胞、染色、封片成像。 本文章介绍新方法，我们将描述在通道载玻片内培养大鼠成纤维细胞（Rat1）的单个实验案例。然后，我们用AlexaFluor®488鬼笔环肽染色F-肌动蛋白细胞骨架，并用DAPI对细胞核进行复染。 该实验包括四个主要步骤： 实验所需材料： • HT1080细胞悬浮液（180µl；3x105 细胞/ml） • 具有10% FCS的DMEM • µ-Slide VI0.4，ibiTreat底部处理（ibidi #80606） • Dulbecco´s PBS • PBS中3.7%多聚甲醛（PFA） • 0.1% Triton® X-100 • PBS中的1% BSA • Alexa Fluor® 488鬼笔苷（0.165 µM） • DAPI（0.1 µg/ml） • ibidi封片剂（ibidi #50001） • 可选：ibidi浸渍油（ibidi #50101） • 在无菌条件下打开 µ-Slide VI 0.4、ibiTreat (80606) 的包装，并将其放在 µ-Slide 架 (80003) 上。 • 在每个通道中加入 30 µl 3x105细胞/ml 大鼠成纤维细胞（Rat1）细胞悬液。如下图所示或我们的网站上所示，直接将移液器加入通道。 • 用随附的盖子盖住。 • 将载玻片放入培养箱 (37 °C; 5% CO2) 培养并让细胞附着 (60 分钟)。然后用 60 µl 无细胞培养基填充两个通道口。 • 孵育过夜。 在固定和透化过程中要小心，通道永远不要变干！通过用下一个冲洗剩余的溶液来交换通道中的液体 固定： • 使用细胞培养抽吸装置从所有通道口中吸出培养基。用 Dulbecco PBS 洗涤细胞，方法是将 200 μl 缓慢加入每个通道的一个空通道口，并从每个通道的相对通道口吸出。不要吸出整个通道体积。 • 用约 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞。20 分钟后，通过用 200 μl PBS 填充一孔并从另一孔中吸出来冲洗通道内的液体；确保通道永不干涸。 透化和封闭： • 如上所述，用 200 μl PBS 再次洗涤细胞。 • 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分钟。 • 用 PBS 洗涤细胞。 • 用 ~100 μl 封闭溶液（PBS 中的 1% BSA）20 分钟。 • 用 PBS 洗涤细胞。 • 使用抽吸装置从通道中取出所有液体。不要让通道变干。 • 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼笔环肽（在 200 μl PBS 和 1% BSA 中）。用 1 毫升注射器注射溶液会有所帮助。在室温下孵育 20 分钟。 • 用 PBS 洗涤细胞。 • 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分钟。 • 用 PBS 清洗细胞并应用 ibidi 封固培养基，直到通道被填满（约 50 μl）。ibidi 封固剂以甘油为基础，并含有用于抗褪色的 DABCO。载玻片可存放约4 周。 在荧光显微镜下选择适当的滤镜，也可以使用浸油观察细胞。 之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于显微镜比如共聚焦显微镜。 超分辨率显微镜 (STED)观察肌动蛋白细胞骨架 µ-Slide VI 0.4与超分辨率显微镜方法兼容，使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白，可以详细观察肌动蛋白细胞骨架。在这个实验中，固定的 Rat1 成纤维细胞与 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 µ-Slide VI 0.4，ibiTreat中孵育。并用 STED 显微镜以创建超分辨率图像。 使用LifeAct-TagGFP2 蛋白对 Rat1 成纤维细胞中的肌动蛋白细胞骨架进行超分辨率显微镜检查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物镜在 STEDYCON 超分辨率 STED 纳米显微镜系统（Abberior Instruments GmbH，德国哥廷根）上进行显微镜检查。 μ-Slide VI 0.4用于获取人 BJ 成纤维细胞的共聚焦图像。用 Drp-1 siRNA 转染细胞并用 MitoTracker Red 染色以观察融合的线粒体。 在 ibidi μ-Slide VI 0.4中培养的人 BJ 成纤维细胞的共聚焦显微镜图像。MitoTracker Red（红色）用于可视化线粒体。图片由土耳其伊斯坦布尔哈里克大学医学院的 Fulya Dal Yontem 提供。 用于肌动蛋白可视化的荧光显微镜 在这个例子中，A549 细胞（肺泡上皮细胞）在 μ-Slide VI 0.4，ibiTreat上培养，以研究促炎刺激对细胞骨架重排的影响。将细胞暴露于内毒素 (LPS) 中 4 小时，并用荧光鬼笔环肽染色以观察细胞收缩和细胞间间隙的出现。 A549 细胞在 μ-Slide VI 0.4、ibiTreat 上生长，暴露于内毒素 (LPS) 4 小时，并用荧光鬼笔环肽染色以检测细胞肌动蛋白（红色）。40 倍放大倍率。图片由美国弗吉尼亚州里士满弗吉尼亚联邦大学的 Bernard Fisher 提供。
