江莱生物 | 做好这几点,你就是ELISA大神!

 
点击 12回复 0 原帖 2023-10-26 15:58 IP属地 江苏南京

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ELISA实验步骤少,流程短,购买的即用型试剂盒也都有指导性很强的操作说明书,单次实验 3-6 小时即可得到结果,实验小白也可以很快上手。


但是,各位江米们可不要轻视哦,ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样,都是易学难精,上手容易,但想要得到稳定的结果,还是要花一点心思的。


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No.1  试剂盒回温




按照说明书要求,取出试剂盒内组分,摇匀,置于室温(20-25℃)充分回温。若回温不充分,可能会造成检测结果存在较大偏差。


No.2  样品及试剂准备




1
样品准备
  • 按照说明书要求选取和处理样品,如血清样品应避免使用溶血或凝固不全的样品。

  • 样品稀释时,应首先保证样品已恢复至室温,选用一次性样品稀释板稀释样品,然后用排枪转移至ELISA板,保证样品孵育时间一致。禁止使用具有吸附性的细胞培养板

  • 合理安排检测量,避免ELISA板过多,造成洗板等待时间过长。


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洗涤液配制

配置洗涤液的蒸馏水或去离子水也需提前回温。若环境温度较低,可置于25℃恒温箱内回温。


3
浓缩酶标抗体配制

按说明书配置方法,现用现配。建议使用一次性离心管配制,涡旋振荡,充分混匀


样本制备可参考

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No.3  操作注意事项




1
加样
  • 吸取液体时选用的移液器量程和所需量接近,添加通用试剂时可反向移液,减小误差。

  • 样品开盖时尽量远离稀释板,防止液滴迸溅到稀释板孔中。

  • 转移样品时稀释板在上,ELISA板在下,防止交叉污染。

2
温育

加液结束后加盖封板膜,使用恒温恒湿培养箱(注意要提前打开培养箱,确保孵育时到达所需温度),若培养箱不能保证恒湿条件,可自制湿盒,避免培养箱内过于干燥,致使孔内样品蒸发。


温育操作可参考


3
洗板

洗涤时可使用自动洗板机或多通道移液器

  • 手动洗板时,快速翻转ELISA板将孔内溶液甩出,避免孔间交叉污染

  • 每次加入洗涤液后,轻轻震荡ELISA板后甩出洗涤液,确保洗涤充分。

  • 最后一次洗涤去除洗涤液前,确保下一步要添加的试剂可直接使用,勿使ELISA板处于干燥状态下的时间超过一定时限。

  • 最后一次洗涤后,将ELISA板置于吸水纸上轻轻拍干


洗板操作可参考


4
底物显色

底物溶液需避光放置,加样时动作迅速,板间加样时间差距不宜过大。室温下避光孵育


5
终止反应

加终止液时动作迅速,加完后充分混匀再读取数值


6
读取计算
  • 加入终止液后5分钟内完成读数,避免因反应时间过长,影响实验结果的准确性

  • 读数前打开酶标仪,确保酶标仪充分预热通过自检,使结果更稳定。

  • 酶标仪需定期校准,避免读数存在过大偏差。


结果计算可参考

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No.4  其他注意事项




⚠ 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃使用后立即冷藏保存试剂。

⚠ 试剂盒严格按照说明书规定温度(一般2-8℃)保存。

⚠ 使用微量移液器时,吸取不同的液体后要注意更换枪头,防止污染。

⚠ 消除板底残留的液体和手指印,否则影响 OD 值。

⚠ 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

⚠ 在储存和温育时避免强光直接照射和检测装置。


ELISA实验现在已成为实验室最为常见的实验,几乎人人都能做,但真正做好的没有几个,究其原因就是步骤比较简单,一学就会,却往往抓不往关键,一个小环节的错误,最终会影响整个实验结果,注意以上这些可以帮助我们高效高质的完成ELISA试验。



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